サンプル収集に関わるすべての手順は、当施設のIRBガイドラインに従って実施されました。 抗体または血清の希釈および感染 注：本プロトコルは、コロナウイルススパイクタンパク質および強化緑色蛍光タンパク質を発現する水疱性口炎ウイルス（VSV-S-eGFP）擬似ウイルスの中和能を、市販の抗体、患者血清、および前臨床ワクチン開発研究用に動物から収集した血清を用いて測定する場合に適用できます。 連続希釈系列 血清サンプルを希釈する前に、補体を不活化させるため、各サンプルを56 °Cの恒温水槽で30分間加熱不活化してください。患者サンプルを扱う際は、必要な安全対策を講じてください。サンプルの容器は組織培養用フード内でのみ開封し、適切なバイオセーフティーレベル2（BSL-2）の個人用保護具を着用してください。 空の96ウェルプレート（プレート1）に希釈系列をセットアップします。 96ウェルプレートの行Aにて、すべての希釈を80 µLで開始します。*患者サンプルの場合、8 µLの血清を72 µLの無血清Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)（1%ペニシリン/ストレプトマイシン含有）に加えることで、10倍希釈から希釈系列を開始してください。 注：使用する中和抗体の濃度は、製造元が予測した活性によって異なります。本手順で使用したSARS-CoV-2スパイク中和抗体（材料表を参照）の場合、少なくとも50%の中和を観察するために5 µg/mLから開始してください。 行BからGに40 µLの無血清DMEM（1%ペニシリン/ストレプトマイシン含有）を、行Hに80 µLを加えてください。行Hは細胞のみのコントロールとして使用するため、ウイルスは加えないでください。 12チャンネルマルチピペットを使用して、希釈した血清または抗体40 µLを行Aから行Bへ混合および転送します。行Fまで混合と転送を繰り返し、行Fから40 µLを廃棄します。行Gはウイルスのみのコントロール行となるため、血清は加えないでください。 感染およびオーバーレイ 各ウェルを感染多重度（MOI）0.05（または2000プラーク形成単位（pfu））で処理するために、適切な量の希釈VSV-S-eGFPを調製します。（この計算を行う際は、全量80 µLのうち60 µLのみが細胞に転送されることを考慮してください。したがって、2000 pfuを維持するために、ウイルスの量を1.33倍にしてください）。 注：VSV-S-eGFPは温度感受性であるため、使用していないときは常にウイルスストックを氷上に保持し、繰り返しの凍結融解サイクルを避けてください。繰り返しの凍結により力価が変動します。 プレート1の行AからGの各ウェルに希釈ウイルス40 µLを加え、ピペッティングで4〜5回混ぜ合わせます。プレートを37 °C、5% CO2条件下で1時間インキュベートします。 インキュベーターから細胞を含むプレート（プレート2）を取り出し、すべてのウェルから培地を慎重に吸引します。プレート1から抗体/ウイルス混合液60 µLをプレート2に転送し、37 °C、5% CO2条件下で1時間インキュベートし、20分ごとにプレートをロッキングします。 各ウェルに、最終濃度が3% CMC（10% FBS（ウシ胎児血清）および1%ペニシリン/ストレプトマイシン含有）となるよう、DMEM中のカルボキシメチルセルロース（CMC）を含むオーバーレイ液140 µLを補充します。プレート2を34 °C、5% CO2に設定したインキュベーターに設置し、イメージングまで約24時間保持します。 注：感染ステップの間に、オーバーレイ混合液を37 °Cの恒温水槽で15分間予熱しておいてください。 2. イメージングおよび定量（3日目） 自動蛍光イメージング装置（フルオレセインイソチオシアネート（FITC）フィルターまたは励起波長488 nmの代替フィルターを使用）を用いてプレートをイメージングします。個々のeGFP（強化緑色蛍光タンパク質）フォーカスを自動的に識別してカウントするプロトコルを作成し、ウイルス感染量を定量します。自動カウント機能が利用できない場合は、ImageJソフトウェアを使用してeGFPフォーカスの数を定量してください。 Jamieson, T. R., 他 擬似ウイルス感染の高スループット蛍光イメージングを用いたSARS-CoV-2中和抗体の検出 J. Vis. Exp. (2021)
このビデオでは、感染した上皮細胞単層の高スループット蛍光イメージングを用いて、患者血清によるコロナウイルススパイクタンパク質保持擬似ウイルスの抗体介在性中和を実演します。
