1. 細胞の播種 プレートからHeLa細胞を回収し、増殖培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM]、2 mM L-glut、10% ウシ胎児血清 [FBS]）を用いて約2.0 x 10⁵ cells/mlに希釈する。黒壁・透明平底96ウェルプレートに100 μl/ウェルずつ分注する（20,000 cells/ウェル）。37 °C、5% CO₂インキュベーター内で、細胞がコンフルエントになるまで24時間培養する。 2. 細胞への感染 ウイルスを希釈し、細胞に感染させる。 TrpV（Triple virus；早期Venus、中期mCherry、後期TagBFP）およびPLV（プロモーター欠損Venus）蛍光ウイルスを融解し、超音波処理を5分間行い凝集を解消する。あるいは、粗ウイルスストックを感染培地中の0.25 mg/ml トリプシンと1:1で混合し、37 °Cで30分間インキュベートしてもよい。 粗ウイルスストックを37 °Cの感染培地（DMEM、2 mM L-glut、2% FBS）で希釈する。高MOI感染（10 PFU/cell）の場合、5 x 10⁴ cells/ウェルおよび接種量50 μlと想定して、ウイルスストックを1.0 x 10⁷ PFU/mlに希釈する。各処理について、TrpVで3つの反復ウェル、PLVでさらに3つの反復ウェルに感染させ、各処理に特異的な背景蛍光を考慮するように計画する。 希釈したウイルスを感染培地を用いて50 μl/ウェル添加し、感染させる。これを感染後0時間（0 hpi）と定義する。 37 °C、5% CO₂インキュベーター内で6～24時間培養する。 3. 細胞の固定 各ウェルの感染培地に8% パラホルムアルデヒドを100 μl添加して細胞を固定する。遮光条件下、室温で15分間インキュベートする。 注意：固定前に高タイターの培地を廃棄容器に直接反転させて捨てると、感染性ワクシニアウイルスがエアロゾル化する可能性があるため、2x パラホルムアルデヒド（8%）を感染培地に直接添加することが推奨される。 プレートを廃棄容器に反転させて固定液を除去する。 室温のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を100 μl添加する。 光学的に透明な粘着フィルムでプレートを密封する。 注意：すぐに測定しない場合は、プレートを4 °Cで保存できる。ただし、結露によって分光光度計の測定値が歪むのを防ぐため、測定前に必ず密封したプレートを室温に戻すこと。 Rozelle, D. K., 他 遺伝子発現のあらゆる段階におけるウイルス機能を定量化するためのワクシニア・レポーターウイルス。 J. Vis. Exp. (2014)
このビデオでは、ステージ特異的プロモーターによって制御される蛍光レポーターを用いて、ワクシニアウイルスの複製をモニタリングする方法を説明します。緑色、赤色、および青色の蛍光タンパク質が順次発現することで、感染の初期、中期、および後期のフェーズが標識され、ステージ特異的なウイルス遺伝子発現の高スループット解析が可能になります。
