感染昆虫個体からのウイルスの単離および精製

要約

全ウイルス抽出 ウイルス陽性のH. vitripennisの全個体を、pH約7.2、0.02%ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム三水和物（DETCA）含有リン酸緩衝液中で、組織の大きな塊がなくなるまで約10秒間隔でボルテックスして均質化する。124,500 x gで4時間（4 °C）、または22,000 x gで16時間（4 °C）の超高速遠心分離によりウイルスを抽出する。上部に沈殿物が形成された場合は、滅菌綿棒で除去する。上清は捨てる。ペレットを回収し、0.4%Na-デオキシコール酸および4%ポリエチレングリコールヘキサデシルエーテル（Brij 52）を含む、pH約7.2の10 mMリン酸緩衝液（DETCAなし）5 mlで溶解させる。ペレットを十分に混合するため、必要に応じてチューブの側壁からペレットを剥がし、溶解するまで砕く。必要に応じて、ペレットの溶解を促進するために10 mMリン酸緩衝液を約5 mlずつ追加し、2本のチューブに分ける。溶液を300 x gで15分間遠心分離する。上清を除去し、溶液を0.45 μmフィルターに通して、ろ液を大きな回収チューブに回収する。必要に応じてDETCAを含まない10 mMリン酸緩衝液（pH 7）を少量使用し、ろ液を分画分子量（MWCO）3.5 kDの透析膜に移す。透析膜を4 °CのddH2Oを満たした大きなビーカーに入れる。膜内に白い沈殿が形成されるまで、5～6時間、1時間ごとにddH2Oを交換する。膜内から精製ウイルスを回収し、100%ウイルス溶液10 μlを90 μlのddH2Oに加えることで10倍段階希釈系列を作成する。続いて、希釈液10 μlをさらに90 μlのddH2Oに加える操作を、希釈倍率が1:100,000になるまで繰り返す。ウイルス溶液は-80 °Cで保存する。 Biesbrock, A. M. 他 の増殖 Homalodisca coagulata virus-01 ～により *Homalodisca vitripennis* 細胞培養 J. Vis. Exp. (2014)

このビデオでは、昆虫由来の宿主細胞を用いたHomalodisca coagulata Virus-01のin vitro増殖について実演します。ウイルスの精製、接種、および培養昆虫細胞内での複製の手順について概説します。

プロトコル

1. 全ウイルス抽出

1. ウイルス陽性のH. vitripennisの全個体を、0.02%ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム三水和物（DETCA）を含むリン酸緩衝液（pH ~7.2）中で、組織の大きな塊がなくなるまで約10秒間隔でボルテックスして均質化する。超高速遠心分離（124,500 x gで4時間、4 °C、または22,000 x gで16時間、4 °C）によりウイルスを抽出する。上部に沈殿物が形成された場合は、滅菌綿棒で取り除く。
2. 上清を捨てる。
3. ペレットを回収し、0.4%Na-デオキシコール酸および4%ポリエチレングリコールヘキサデシルエーテル（Brij 52）を含む10 mMリン酸緩衝液（DETCAなし、pH ~7.2）5 mlで溶解させる。
   1. ペレットを十分に混合させるため、必要に応じてチューブの壁面からペレットを剥がし、溶解するまで砕く。
   2. 必要に応じて、ペレットの溶解を助けるために10 mMリン酸緩衝液を約5 mlずつ追加し、2本のチューブに分けてまとめる。
4. 溶液を300 x gで15分間遠心分離する。
5. 上清を除去し、溶液を0.45 μmフィルターに通して、ろ液を大きな回収チューブに回収する。
6. ろ液を分画分子量（MWCO）3.5 kDの透析膜に移す。必要に応じて、DETCAを含まない少量の10 mMリン酸緩衝液（pH 7）を使用する。
7. 透析膜をddH₂Oで満たした大きなビーカーに入れ、4 °Cで保持する。膜の中に白い沈殿物が形成されるまで、5〜6時間、1時間ごとにddH₂Oを交換する。
8. 膜内部から精製ウイルスを回収し、ウイルス原液10 μlを90 μlのddH₂Oに加えることで10倍段階希釈系列を作成する。その後、希釈液10 μlをさらに90 μlのddH₂Oに加え、希釈倍率が1:100,000に達するまでこれを繰り返す。
9. ウイルス溶液を-80 °Cで保存する。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Corning cell culture flasks	Sigma Aldrich	CLS430168	表面積 25 cm²、傾斜ネック、キャップ（プラグシール）
Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71	Olympus		倒立顕微鏡およびカメラ
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates	Sigma Aldrich	M8937	48ウェル（TC処理済み、蓋付き）
DETCA	Sigma Aldrich	228680	ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム三水和物
Corning bottle-top vacuum filter system	Sigma Aldrich	CLS431206	酢酸セルロース膜、孔径 0.45 μm、膜面積 54.5 cm²、ろ過容量 500 ml
Brij 52	Sigma Aldrich	388831	ポリエチレングリコール ヘキサデシルエーテル
Phosphate buffer solution	Sigma Aldrich	P5244	100 mMとして受領し、滅菌水で10 mMに希釈
PBS	Sigma Aldrich	P5368	リン酸緩衝生理食塩水
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A2153
Grace’s Insect medium (supplemented, 1x)	Sigma Aldrich	G8142	H2G+ ヨコバイ培地成分
L-histidine monohydrate	Sigma Aldrich	H8125	H2G+ ヨコバイ培地成分
Medium 199 (10x)	Sigma Aldrich	M4530	H2G+ ヨコバイ培地成分
Medium 1066 (1x)	Sigma Aldrich	C0422	H2G+ ヨコバイ培地成分
Hank’s Balanced Salts (1x)	Sigma Aldrich	51322C	H2G+ ヨコバイ培地成分
L-Glutamine (100x)	Sigma Aldrich	G3126	H2G+ ヨコバイ培地成分
MEM, amino acid mix (50x)	Sigma Aldrich	56419C	H2G+ ヨコバイ培地成分
1 M MgCl solution	Sigma Aldrich	M8266	H2G+ ヨコバイ培地成分
Pen-Strep	Sigma Aldrich	G6784	H2G+ ヨコバイ培地成分
Nystatin	Sigma Aldrich	N6261	H2G+ ヨコバイ培地成分
Gentamycin	Sigma Aldrich	46305	H2G+ ヨコバイ培地成分
Dextrose	Sigma Aldrich	D9434	H2G+ ヨコバイ培地成分
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	F2442	H2G+ ヨコバイ培地成分