転写・複製能を有するウイルス様粒子（trVLP）の初期生産のためのプロデューサー細胞へのトランスフェクション 細胞を播種して24時間後（実験スケジュールの概要は図1を参照）、フィルターチップを用いてプラスミドDNA（量は表1を参照）を滅菌済みの2 mLクライオバイアルに分注する。DNAにウェルあたり100 µLのOptiMEMを加える。混合物を短時間ボルテックスし、マイクロ遠心機を用いてチューブ内の液体を穏やかに回収する。同一のプラスミドを複数のウェルにトランスフェクションする場合は、複数ウェル分のマスターミックスを作成してもよい。 使用前にTransit LT1のバイアルを短時間ボルテックスする。希釈したDNAにウェルあたり7.5 µLのTransit LT1を加える。クライオバイアルの蓋に液体が付着しないように注意しながら混合物を穏やかにボルテックスし、室温で15分間インキュベートする。 ピペッティングによりトランスフェクション複合体を穏やかに混合する。各ウェルにトランスフェクション複合体100 µLを滴下して加える。プレートを前後左右に揺らしてトランスフェクション複合体を分散させる。プレートを回転させるとトランスフェクション複合体が不均一に広がるため、旋回させないこと。 細胞をインキュベーターに戻す。 24時間後、細胞から上清を除去する。細胞に5% FBS（ウシ胎児血清）、2 mM L-glutamine、1x pen/strep（ペニシリン/ストレプトマイシン）を含む4 mLのDMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）（DMEM5）を加える。ウェルが乾燥しない範囲であれば、同一のサンプルを含む場合に限り、一度に最大3ウェルまでこの操作を行うことができる（それ以外の場合、本システムにおけるtrVLP（転写・複製能を有するウイルス様粒子）の自己増幅能により、クロスコンタミネーションの問題が生じる可能性があるため、この操作は1ウェルずつ行う必要がある）。 細胞をインキュベーターに戻す。 表1. トランスフェクションに使用するDNA量。プロデューサー細胞およびターゲット細胞のトランスフェクションに必要な各プラスミドの量を、6ウェルプレートの1ウェルあたりngで示す。 | | プロデューサー細胞 (p0) | ターゲット細胞 (p1以降) | | :--- | :---: | :---: | | pCAGGS-NP | 125 | 125 | | pCAGGS-VP35 | 125 | 125 | | pCAGGS-VP30 | 75 | 75 | | pCAGGS-L | 1,000 | 1,000 | | p4cis-vRNA-RLuc | 250 | - | | pCAGGS-T7 | 250 | - | | pCAGGS-Tim1-2 | 50 | - | Hoenen, T., 他 テトラシストロン性ミニゲノムを含むウイルス様粒子を用いた、バイオセーフティレベル2条件下でのエボラウイルスのライフサイクルのモデル化 J. Vis. Exp. (2014)
このビデオでは、エボラウイルスゲノムを模倣したテトラシストロニック・ミニゲノムプラスミドとヘルパープラスミドをヒト細胞にトランスフェクションする方法を実演します。細胞内でウイルス蛋白質とルシフェラーゼが発現し、非病原性で複製能を持つウイルス様粒子の構築と出芽が誘導されます。
