ヒト胚性腎細胞における抗ウイルス化合物を評価するためのルシフェラーゼベースアッセイ

要約

1. ホタルルシフェラーゼ発現麻疹ウイルス（rMV2/Luc）感染細胞培養液の調製 安定化L-グルタミンを含むDulbecco's modified Eagle's medium（DMEM）に、10%ウシ胎児血清（FCS）、ストレプトマイシン（100 μg/ml）、およびペニシリン（100 IU/ml）を添加した培地を用い、HEK-293T細胞を37 °C、5% CO2条件下で培養する。4〜5日ごとにトリプシン処理により継代し、新鮮なフラスコに1:10に希釈して播種する。実験には対数増殖期の細胞を用いる。 実験当日、トリプシン処理により細胞を回収し、細胞数を計測する。遠心分離で細胞をペレット化し、培養液中で3 x 10⁵ cells/mlに再懸濁する。スクリーニングプレート1枚につき12.5 mlの細胞懸濁液が必要となる。 （繰り返し：培養液中で細胞を3 x 10⁵ cells/mlに再懸濁する。スクリーニングプレート1枚につき12.5 mlの細胞懸濁液が必要となる。） オプション：培養液に20 μg/mlのウリジンを添加する。 注：ウイルス複製阻害剤の化学ライブラリースクリーニングにおいて、ピリミジン生合成経路の初期段階を標的とする化合物が頻繁に単離される傾向がある。培養液へのウリジンの添加は、このような抗ウイルス分子を除外するために行われる。実際に、ピリミジン生合成経路の上流酵素がブロックされた場合、ウリジンの添加によってウイルスの複製が効率的に回復する。 細胞懸濁液の1/10を非感染細胞を用いたコントロールウェル用に保存し、残りの量を用いて感染操作を行う。 rMV2/Lucストック溶液を適量解凍する。MVストック溶液の濃度は通常、1 mlあたり10⁶〜10⁸感染粒子である。標的細胞1個あたり0.1感染粒子のrMV2/Lucで感染させる。これは感染多重度（MOI）0.1に相当する。注：rMV2/LucはMVワクチン株（Schwarz株）由来であり、BSL2環境下で取り扱う。 ウイルスを細胞懸濁液に加え、穏やかに混ぜる。感染細胞をtroughに移し、化学化合物が添加済みのD2プレートの2列目から11列目に、感染細胞懸濁液を100 μlずつ分注する。trough内の細胞懸濁液は、適宜穏やかに混ぜ合わせる。 1列目と12列目には、非感染細胞を各ウェルに100 μlずつ分注する。その他のウェルには感染細胞を分注する。 細胞を37 °C、5% CO2条件下で24時間インキュベートする。 2. 毒性および広域抗ウイルス活性の二次スクリーニング ヒット化合物について、ジメチルスルホキシド（DMSO）を用いて500 µMから4 µMまで1:2の連続希釈系列（8段階）を作成する。バーコード付きの白色組織培養プレートに、培養液を50 µlずつ満たす。各化合物の希釈液を1 µlずつ培養ウェルに添加する。この操作を2回繰り返し、各ヒット化合物の二連希釈系列を含む培養プレートを3枚用意する。 上述の手順（1.1および1.2）に従い、培養液中で6 x 10⁵ cells/mlとなるHEK-293T細胞懸濁液を37.5 ml調製する。Falconチューブに12.5 mlずつ2本に分注し、rMV2/Luc（MOI = 0.1）またはRenillaルシフェラーゼ発現組換えチクングニヤウイルス（CHIKV/Ren）（MOI = 0.2）で細胞を感染させる。転倒混和により混ぜ合わせる。 注：CHIKV/RenはCHIKVの野生株由来であるため、BSL3環境下で取り扱う必要がある。Renilla基質を培養ウェルに添加した後は、プレートをBSL3からBSL1へ移動させることができる（後述）。 ヒット化合物の連続希釈液を含む培養プレートに、非感染細胞、rMV2/Luc感染細胞、またはCHIKV/Ren感染細胞を50 µlずつ分注する。37 °Cで24時間インキュベートする。 rMV2/Luc感染ウェルにホタルルシフェラーゼ基質を50 µl添加し、ホタルルシフェラーゼ活性を測定する。CHIKV/Ren感染ウェルにRenillaルシフェラーゼ基質を50 µl添加し、Renillaルシフェラーゼ活性を測定する。最後に、非感染細胞にルシフェラーゼベースの生存率測定試薬を50 µl添加し、細胞生存率を測定する。 データをプロットし（図1）、MVおよびCHIKVの複製を50%阻害するヒット化合物の濃度を決定する。本アッセイにおいて毒性を示した化合物は除外する。 Lucas-Hourani, M. 他、 RNAウイルスの広域化学的阻害剤の高スループットスクリーニング J. Vis. Exp. (2014)

このビデオでは、組換え麻疹ウイルスに感染させたヒト胚性腎細胞を用いたルシフェラーゼベースの抗ウイルスアッセイを紹介します。段階希釈した被験化合物がウイルスの複製を抑制し、宿主細胞の生存能を維持しつつ、濃度依存的に発光量が低下することが示されています。

プロトコル

1. ホタルルシフェラーゼ発現麻疹ウイルス（rMV2/Luc）感染細胞培養の調製

1. HEK-293T細胞を、安定化L-グルタミンを含むDulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)に10%胎児牛血清 (FCS)、ストレプトマイシン (100 μg/ml)、およびペニシリン (100 IU/ml) を添加し、37 °C、5% CO₂で培養する。細胞は4〜5日ごとにトリプシン処理により継代し、新しいフラスコに1:10に希釈して播種する。実験には対数増殖期の細胞を使用すること。
2. 実験当日、トリプシン処理により細胞を回収し、細胞数を計測する。遠心分離により細胞をペレット化し、培養液で3 x 10⁵ cells/mlに再懸濁する。スクリーニングプレート1枚につき12.5 mlの細胞懸濁液が必要であることを考慮する。
3. 再度、培養液で細胞を3 x 10⁵ cells/mlに再懸濁する。スクリーニングプレート1枚につき12.5 mlの細胞懸濁液が必要であることを考慮する。
4. オプション：培養液に20 μg/mlのウリジンを添加する。
   注：ウイルス複製阻害剤を目的とした化学ライブラリーのスクリーニングでは、ピリミジン生合成経路の初期段階を標的とする化合物が頻繁に単離される傾向がある。培養液にウリジンを添加することで、このような抗ウイルス分子を除外できる。実際に、ピリミジン生合成経路の上流酵素が阻害されている場合に、ウリジンの添加はウイルスの複製を効率的に回復させる。
5. 細胞懸濁液の1/10を非感染細胞を用いたコントロールウェル用に確保し、残りの量で感染操作に進む。
6. 適切な量のrMV2/Lucストック溶液を融解する。MVストック溶液の濃度は通常、1 mlあたり10⁶-10⁸感染粒子である。標的細胞1個あたり0.1個のrMV2/Luc感染粒子、すなわち感染多重度 (MOI) 0.1で感染させる。 
   注：rMV2/LucはMVワクチン（Schwarz株）由来であり、BSL2環境下で取り扱う。
7. ウイルスを細胞懸濁液に加えて穏やかに混合する。感染細胞をリザーバーに移し、化学化合物が添加されたD2プレートの2列目から11列目まで、感染細胞懸濁液を100 μlずつ分注する。リザーバー内の細胞懸濁液は、定期的に穏やかに混合する。
8. 1列目と12列目の各ウェルには、非感染細胞を100 μlずつ分注する。その他のウェルには感染細胞を分注する。
9. 細胞を37 °C、5% CO₂で24時間インキュベートする。

2. 毒性および広範囲抗ウイルス活性の二次スクリーニング

1. ジメチルスルホキシド（DMSO）を用いて、各ヒット化合物を500 µMから4 µMまで1:2の段階希釈（計8段階）で調製する。バーコード付きの白色組織培養プレートに、培養液を50 µlずつ分注する。各化合物の希釈液を1 µlずつ培養ウェルに添加する。この操作を2回繰り返し、各ヒット化合物の二連段階希釈を含む3枚の培養プレートを用意する。
2. 上述の通り（1.1および1.2）に、培養液中で6 x 10⁵ cells/mlのHEK-293T細胞懸濁液を37.5 ml調製する。これをFalconチューブに12.5 mlずつ2本分注し、rMV2/Luc（MOI = 0.1）またはRenillaルシフェラーゼを発現する組換えチクングニアウイルス（CHIKV/Ren）（MOI = 0.2）で細胞を感染させる。転倒混和して混ぜる。
   注：CHIKV/RenはCHIKVの野生型株に由来するため、BSL3環境で取り扱う必要がある。Renilla基質を培養ウェルに添加した後は、プレートをBSL3からBSL1へ移動させることができる（後述）。
3. 未感染細胞、rMV2/Luc感染細胞、またはCHIKV/Ren感染細胞のいずれかを50 µlずつ、ヒット化合物の段階希釈を含む培養プレートに分注する。37 °Cで24時間インキュベートする。
4. rMV2/Luc感染ウェルにホタルルシフェラーゼ基質を50 µl添加し、ホタルルシフェラーゼ活性を測定する。CHIKV/Ren感染ウェルにRenillaルシフェラーゼ基質を50 µl添加し、Renillaルシフェラーゼ活性を測定する。最後に、未感染細胞にルシフェラーゼベースの生存率測定試薬を50 µl添加し、細胞生存率を測定する。
5. データをプロットし（図1）、MVおよびCHIKVの複製を50%抑制するヒット化合物の濃度を決定する。このアッセイで毒性を示した化合物は除外する。

結果

図1. 化合物C864、C648、C062の用量反応的な抗ウイルス活性および毒性。(A) HEK-293T細胞にルシフェラーゼを発現するMVのrMV2/Luc株を感染させ（MOI=0.1）、C864、C648、C062を段階的に増量して添加するか、あるいはDMSOのみを添加してインキュベートした。24時間後、ルシフェラーゼ発現量を測定した。*は、3つの化合物すべてにおいて観察されたルシフェラーゼ抑制が統計的に有意であることを示す（p-values < 0.05）。(B) HEK-293T細胞にRenillaルシフェラーゼを発現するCHIKVのCHIKV/Ren株を感染させ（MOI=0.2）、C864、C648、C062を段階的に増量して添加するか、あるいはDMSOのみを添加してインキュベートした。24時間後、Renillaルシフェラーゼ発現量を測定した。*は、3つの化合物すべてにおいて統計的に有意な抑制が見られたことを示す（p-values < 0.05）。(C) HEK-293T細胞を、C864、C648、C062の段階的な増量、またはDMSOのみでインキュベートした。毒性のコントロールとして、細胞培養液に0.5% IGEPAL溶液 2.5 μlを添加した。24時間後、ルシフェラーゼベースの生存率アッセイを用いて生存細胞数を測定した。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Freedom EVO platform	TECAN		ロボットプラットフォーム
96-well polystyrene cell culture microplates, white	Greiner Bio One	655083
CellTiter-Glo luminescent cell viability assay	Promega	G7570	ルシフェラーゼベースの細胞生存率アッセイ
Bright-Glo luciferase assay system	Promega	E2610	ホタルルシフェラーゼ基質含有試薬
Renilla-Glo luciferase assay system	Promega	E2710	Renillaルシフェラーゼ基質含有試薬
Britelite plus reporter gene assay system	Perkin-Elmer	6016761	ホタルルシフェラーゼ基質含有試薬。ルシフェラーゼ活性を測定するためのBright-Glo試薬の代替として使用可能。