アメーバを用いた混合ウイルス集団からの単一ジャイアントウイルスの分離

要約

出典： Sahmi-Bounsiar, D. 他 巨大ウイルス混合物の分離における、フローサイトメトリー（蛍光活性化細胞分取）に代わる戦略としての単一細胞マイクロアスピレーション。 J. Vis. Exp. (2019)

このビデオでは、アメーバを宿主細胞として用い、混合ウイルス集団から単一の巨大ウイルス集団を分離・増殖させるための単一細胞マイクロアスピレーションの手法を実演します。

プロトコル

1. アメーバの培養

1. 使用方法 Vermamoeba vermiformis （CDC19株）を細胞サポートとして。
2. 30 mLのプロテアーゼ・ペプトン・酵母エキス・グルコース培地（PYG）を添加する（表1）および、濃度1 x 10のアメーバ3 mL⁶ cells/mLを75 cm² 細胞培養フラスコ
3. 培養を以下の条件で維持してください。 28 °C.
4. 48時間後、計数盤を用いてアメーバの数を定量する。
5. 洗浄するため、1 x 10⁶ cells/mLとし、720 x gで10分間遠心分離してアメーバをペレット化する。上清を除去し、ペレットを適切な量の飢餓培地で再懸濁して1 x 10⁶ 個/mL (表1).

2. 限界希釈

1. 飢餓培地を用いて、ウイルスサンプルの段階希釈（10^-1から10^-11）を行う（表1）。
2. 各ペトリ皿に1 x 10⁶ Vermamoeba vermiformisを2 mL分接種し、そこに100 µLの混合接種液を加える。
3. ペトリ皿を密閉可能なプラスチック袋に入れ、30 °Cで保持する。
4. 感染後6時間から倒立光学顕微鏡による観察を開始し、4〜8時間ごとに細胞の形態を確認する。
5. 細胞の円形化を特徴とする細胞変性効果（CPE）が現れた時点で、単一細胞マイクロアスピレーションの手順を開始する。

3. 単一細胞マイクロアスピレーション

1. ホスト細胞の準備
   注記：この準備は、感染した単一細胞を新しい細胞支持体へ放出するために行われます。
   1. 培養中のアメーバを、10 µg/mLのvancomycin、10 µg/mLのimipenem、20 µg/mLのciprofloxacin、20 µg/mLのdoxycycline、および20 µg/mLのvoriconazoleを含む抗菌剤で処理します。この混合液は、細菌および真菌の汚染を防ぐために使用されます。
      注記：この操作は、微生物安全作業台の外のベンチ上で行います。1 x 10⁶ cells/mLに濃縮したアメーバを2 mLずつ、15枚のペトリ皿に分注します。アメーバを接着させるため、培養液を30 °Cで30分間インキュベートします。
2. 限界希釈後、以下の基準に従ってマイクロアスピレーションに使用するペトリ皿を選択します。1) 真菌および細菌による目に見える汚染がないこと、2) ウイルスによるアメーバの細胞変性効果が認められること、3) アメーバが前溶出期および円形化期にあること（ウイルス粒子の吸引を避けるため）。
3. 以下の器材を用いてワークステーションをセットアップします（Figure 1A,B）：マイクロキャピラリーの配置を行うマイクロマニピュレーター、細胞をマイクロキャピラリー内に吸引および放出するための手動圧力制御装置、倒立顕微鏡、プラグアンドプレイ方式のモーターモジュール、カメラ、操作の可視化および写真撮影用のコンピューターモジュール。
4. マイクロキャピラリーを選択します（Figure 1C）。
   注記：細胞のサイズ、細胞膜の表面への変形や接着、および細胞の運動性は、マイクロアスピレーションの円滑な進行に影響を与える可能性があります。マイクロキャピラリーの直径は、細胞のサイズや吸引方法に応じて、特定の細胞タイプに合わせて精密に選択し、調整することができます。円形化したアメーバ（直径 〜10 µm）を吸引するために、内径20 µmのマイクロキャピラリーを使用しました。これにより、内部位置の保持と細胞の容易な放出が可能になります。
5. システムの組み立て。
   1. 電動モジュールのグリッピングシステムの操作角度を45°に固定します。
   2. まずグリッピングシステムに、次にマイクロキャピラリーに、という順で二段階の取り付けを行います。
   3. マイクロキャピラリーにオイルを数滴流した後、細胞に焦点を合わせます。
      注記：生物学的適合性のあるミネラルオイルは、装置から供給されます。
   4. メーカーの推奨事項に従い、組み立てを完了させます。
6. 細胞のクローニング（Figure 2A,B）
   1. 2 mLの感染アメーバを含むペトリ皿を顕微鏡下に置きます。
   2. まず細胞に、次に培養液に浸したマイクロキャピラリーに焦点を合わせます。
   3. 円形化した単一細胞を選択し、マイクロマニピュレーターでマイクロキャピラリーを近づけます。
   4. 手動圧力制御を用いて細胞に緩やかな吸引をかけ、マイクロキャピラリー内に取り込みます。最初のサンプルから単一細胞を取り出し、細胞支持体に放出し、30 °Cでインキュベートします。
   5. 倒立光学顕微鏡を用いて毎日観察を行い、細胞の外観を確認し、細胞変性効果の出現をモニターします。

表1：培地組成

結果

図1：マイクロマニピュレーションに使用する器具。(A) ワークステーションの実際のセットアップ。(B) ワークステーション構成品の概略図。(C) マイクロキャピラリーの概略図。)

図2：マイクロアスピレーションの手順。(A) 単一細胞の分離手順（40倍拡大）。(B) 単一細胞アスピレーションの各ステップの模式図：1) 細胞の位置特定。2) 細胞のアスピレーション。3) 放出ステップ。黒い矢印はマイクロキャピラリーを、白い矢印は単一細胞を示している。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Corning cell culture flasks 150 cm²	Sigma-aldrich	CLS430825	培養
Corning cell culture flasks 25 cm²	Sigma-aldrich	CLS430639	培養
Corning cell culture flasks 75 cm²	Sigma-aldrich	CLS430641	培養
DFC 425C camera	LEICA	Unkown	観察/モニタリング
Eclipse TE2000-S Inverted Microscope	Nikon	Unkown	観察/モニタリング
Microcapillary 20 µm	Eppendorf	5175 107.004	細胞のマイクロアスピレーションおよび回収
Micromanipulator InjectMan NI2	Eppendorf	631-0210	マイクロキャピラリーのポジショニング
Petri dish 35 mm	Ibidi	81158	培養/観察