1. ウイルス懸濁液の調製 フローサイトメトリーによる単一ビリオンの単離に先立ち、非固定のウイルス懸濁液を調製する。既報のプロトコルに従ってウイルス粒子を単離し、最終的なウイルス懸濁液が0.1 μmフィルター滅菌済みのTE（Tris-EDTA, pH 8）に含まれていることを確認する。化学的凝集を用いる他の手法も開発されているが、接線流ろ過（TFF）法の使用を推奨する。エピ蛍光顕微鏡やフローサイトメトリーなどの確立されたプロトコルを用いて、ウイルス粒子数を定量する。ウイルス懸濁液を2本のエッペンドルフチューブに分注する（最終容量は1,000 μlを推奨）。 2. フローサイトメトリー カスタム前方散乱光PMT（FSC PMT）を搭載したBD FACSAria IIフローサイトメーターを用いてウイルスを分取する場合、0.1 μmフィルター滅菌済みのTE（pH 8.0）でウイルス粒子を希釈し、イベントレートが200 events sec-1となる適切なタイターに調整する。 S/N比を最大化するように閾値を設定する。例えば、T4およびλファージ粒子を含む混合集団の場合、FSC PMTを1,000、SSCを200に設定することを推奨する。 以下の「ブランク」サンプル100 μlを解析する：1) 0.1 μmフィルター滅菌済みのTEのみ、および 2) 0.1 μmフィルター滅菌済みのTEにストック液（10,000倍濃縮）を1e-4に希釈したSybrGreen1を加えたもの。 バックグラウンドを評価するため、未染色のウイルス懸濁液の少量分注液（100 μlを推奨）を解析し、続いて染色済みウイルス懸濁液（ストック液を1e-4に希釈したSybrGreen1で染色）を解析し、それぞれ合計5,000イベントまで取得する。これは、分取前に濃度を確認し、必要に応じて分取ゲートを調整するためである。ウイルス粒子の中心にタイトなゲートを設定することを推奨する。また、ゲートの設定にはSYBR GreenとFSC PMTのプロットを用いる。 37 °Cに冷却した1%低融点（LMP）アガロース（TBEバッファー溶液）5 μlを、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）顕微鏡スライド（Electron Microscopy Sciences社製）の各ウェルに加える。 分取したウイルス粒子を回収するため、PTFE顕微鏡スライドをフローサイトメーターにセットする。 SYBR Green染色されたウイルス粒子の分取を開始し、LMPアガロースを塗布したPTFEスライド上に直接回収する。共焦点レーザー走査顕微鏡（CSLM）によるウイルスの深さ方向の検出を容易にするため、一部のウェルには10イベント（ウイルス粒子）以上を分取することを推奨する。 分取完了後、スライドをフローサイトメーターから取り出し、各ウェルに37 °Cに冷却したLMPアガロースをさらに5 μl加え、ウイルス粒子を封入する。 Zeigler Allen, L., 他 「シングルウイルスゲノミクス」を用いた単一ビリオンの単離およびゲノム解析 J. Vis. Exp. (2013).
このビデオでは、蛍光検出と精密な粒子ソーティングを用いることで、混合集団からゲノムを含む個々のウイルスをフローサイトメトリーで単離し、その後のゲノム特性解析に向けてアガロースで封入する方法を解説します。
