1. サンプルの採取 異なる環境および地域から70個のサンプルを採取する。本例では以下を用いる：フランス、サン・ピエール・ド・メイゾアルグ村の汚水サンプル5検体、フランス、マルセイユのパルク・ボレリーにある湖のサンプル15検体、フランス、マルセイユのサメナにある岩礁地帯の堆積物を含む海水サンプル15検体、フランス、アルプスの河川水サンプル25検体、そして最後に、フランス、ラ・シオタの下水サンプル10検体。接種前に、室温で処理なしに1分間ボルテックスしてサンプルを均質化する。 2. 分離手順 ブラインド培養法のための宿主調製およびサンプルの接種 共培養の細胞支持体としてVermamoeba vermiformis（CDC19株）を用いる。 アメーバを28 °Cで、30 mlのプロテアーゼ・ペプトン・酵母エキス・グルコース培地（PYG）を入れた75 cm2の細胞培養フラスコ内で維持する。PYGの組成については表1を確認すること。 注：48時間後、計数スライド（例：Kovaslides）を用いた通常のカウントによりアメーバを定量する。 5 x 105から106 cells/mlの濃度で細胞を回収し、720 x gで10分間遠心分離してアメーバをペレット化する。 吸引により上清を除去し、アメーバペレットを30 mlの滅菌Page'sアメーバ生理食塩水（PAS、表1）に再懸濁する。この洗浄手順を繰り返す。 抗生物質および抗真菌剤混合剤を含む飢餓培地に、約106 amoeba/mlの濃度でアメーバを再懸濁する。飢餓培地はアメーバの生存培地であり、嚢子形成や増殖を起こさずに生存させることができる。組成は表1を確認すること。 注：抗微生物剤混合剤には、10 µg/mlのバンコマイシン、10 µg/mlのイミペネム、20 µg/mlのシプロフロキサシン、20 µg/mlのドキシサイクリン、および20 µg/mlのボリコナゾールが含まれている。この混合剤は、ウイルスの増殖を減少または変化させる可能性のある細菌および真菌の汚染を低減させるために使用した。 各サンプル25 µlを、アメーバの接着に適した96ウェル平底プレート内の200 µlのアメーバ単層に直接接種し、加湿環境下（蒸発を防ぐため、プレートを入れたバッグの中に濡れたコンプレスを配置して加湿環境とする）で30 °Cで培養する。これが一次培養である。2つのウェルにはサンプルを接種せず、アメーバのみとしておき、これを陰性対照とする。この一次培養を3日間インキュベートする。 最初の接種から3日後、顕微鏡観察を行わずに、上述の手順に従って一次培養プレートを新鮮なアメーバに継代培養する。新しいプレートを一次培養と同じ条件で3日間インキュベートする。 これら3日間のインキュベート後、一次培養および継代培養と同様の方法で最終培養を行う。最終培養を2日間インキュベートした後、検出に進む。 表1. 溶液レシピ Bou Khalil, J. Y.,他環境試料からの新規Faustovirus分離のための迅速な戦略： Vermamoeba vermiformis. J. Vis. Exp. (2016)
このビデオでは、後続の検出および分析を可能にするために、アメーバを用いた共培養により環境水サンプルから巨大ウイルスを濃縮する方法を実演します。
