蛍光顕微鏡を用いた感染性C型肝炎ウイルスの定量

要約

ウイルスタイターの測定 96ウェルプレートを用い、未感染のHuh-7.5.1細胞を約3 x 10³ cells/wellで播種する。翌日、HCV RNAをトランスフェクションした細胞から回収した無細胞培養上清を、増殖培地を用いて10倍段階希釈し、Huh-7.5.1細胞に3連で接種する。感染から72時間後に、メタノール（-20 ºCで30分間）を用いて細胞を固定し、HCV NS5Aタンパク質を免疫染色する。細胞をPBSで3回洗浄し、IFAブロッキングバッファーでブロッキングを行う。ウサギ抗NS5Aポリクローナル一次抗体またはマウス抗dsRNAモノクローナル抗体J2を1:200（1 μg/ml）に希釈して使用し、4 ºCで5時間から一晩インキュベートする。一次抗体処理後、細胞をPBSで3回洗浄する。ヤギ抗ウサギIgG-488ポリクローナル二次抗体またはヤギ抗マウスIgG-594ポリクローナル二次抗体を1:1,000（1 μg/ml）に希釈して添加し、室温で1時間インキュベートする。細胞をPBSで3回洗浄し、蛍光顕微鏡で観察する。最高希釈倍率を用いてNS5A陽性フォーカスをカウントし、1ミリリットルあたりの平均フォーカス形成単位（FFU）数を算出する。HCVタイターについては図1を参照すること。 Ren, S., 他C型肝炎ウイルスの複製を解析するためのプロトコル。 J. Vis. Exp. (2014)

このビデオでは、細胞培養中の感染性C型肝炎ウイルスを定量するために用いられる蛍光フォーカスアッセイについて解説します。ウイルス含有上清の段階希釈、肝細胞がん細胞への感染、および抗体を用いた蛍光顕微鏡によるウイルス複製部位の検出について実演します。

プロトコル

1. ウイルスタイターの測定

1. 未感染のHuh-7.5.1細胞を、約3 x 10³ 96ウェルプレートを用い、1ウェルあたりに細胞を播種する。翌日、C型肝炎ウイルス（HCV）RNAを導入した細胞から回収した細胞不含の培養上清を、増殖培地を用いて10倍段階希釈し、Huh-7.5.1細胞に3連で接種する。
2. 感染から72時間後、メタノールを用いて（-20°Cで30分間）細胞を固定する。 ºC) およびHCV NS5Aタンパク質を免疫染色する。
3. 細胞をPBSで3回洗浄し、IFAブロッキングバッファーでブロッキングを行う。
4. ウサギ抗NS5Aポリクローナル一次抗体、またはマウス抗dsRNAモノクローナル抗体J2を1:200（1 μg/ml）で、4℃で5時間から一晩インキュベートする。 ºC.
5. 一次抗体処理後、PBSで細胞を3回洗浄する。
6. ヤギ抗ウサギIgG-488ポリクローナル二次抗体またはヤギ抗マウスIgG-594ポリクローナル二次抗体を1:1,000に希釈して（1 μg/ml)し、室温で1時間インキュベートする。
7. 細胞をPBSで3回洗浄し、蛍光顕微鏡で観察する。
8. 最高希釈倍率のサンプルを用いてNS5A陽性フォーカスをカウントし、1ミリリットルあたりの平均フォーカス形成単位（FFU）数を算出する。参照： 図1 HCVタイターについて。

結果

図1. 野生型HCVの感染性の検証およびウイルスタイターの測定。A) 感染研究には、未感染のHuh-7.5.1細胞を用いた。HCV RNAのトランスフェクション後48時間および96時間（hpt）で回収した細胞不含上清を10倍段階希釈し、96ウェルプレート内の細胞に3連で添加した。感染から72時間後、細胞を固定し、HCV NS5Aタンパク質に対する免疫染色を行った。NS5A陽性に染色された（赤色）細胞がウイルスに感染したものである。フォーカス形成単位（FFU）を評価するため、最高希釈倍率における陽性フォーカス数をカウントした。代表的な画像パネルを示す（スケールバー 100 μm）。B) ウイルスタイターの平均値および標準偏差をFFU/mLでグラフに示した。ポリメラーゼ欠損変異体は感染性粒子を産生しなかった。WT: 野生型、Pol-: ポリメラーゼ欠損。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM)	Fisher Scientific	10-017-CV
Huh-7.5.1	The Scripps Research Institute		本細胞株は、The Scripps Research InstituteとCedars-Sinai Medical Centerの間で締結されたMTAに基づき、Francis Chisari博士からArumugaswami博士に提供されたものである
マウスモノクローナル抗dsRNA抗体 J2	English & Scientific Consulting Kft.	10010200
ヤギ抗ウサギIgG Alexa Fluor 488	Life Technologies	A11008
ヤギ抗ウサギIgG Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020