ウイルス感染細胞における転写抑制の可視化

要約

出典：Kalveram, B. et al. クリックケミストリーを用いてウイルス感染が宿主細胞のRNA合成に及ぼす影響を測定する. J. Vis. Exp. (2013) このビデオでは、クリックケミストリーと蛍光顕微鏡を用いて、哺乳類細胞における新生RNAの転写を可視化する方法を実演します。感染細胞と対照細胞の蛍光信号を比較することにより、ウイルス感染がどのように宿主の転写を抑制するかを明らかにします。 Kalveram, B. 他 クリック化学を用いてウイルス感染が宿主細胞のRNA合成に及ぼす影響を測定する。 J. Vis. Exp. (2013)

このビデオでは、クリックケミストリーと蛍光顕微鏡を用いて、哺乳類細胞における新生RNA転写を可視化する方法を実演します。感染細胞とコントロール細胞の蛍光信号を比較することで、ウイルス感染がいかにして宿主の転写を抑制するかを明らかにします。

プロトコル

1. リフトバレー熱ウイルス（RVFV）MP-12株を用いた細胞感染および5-エチニルウリジン（EU）による新生RNAのラベル化

   1. ヒト胚性腎細胞（HEK293）を、増殖培地（10%胎児ウシ血清、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシンを含むDulbecco改良イーグル培地（DMEM））を用いて6ウェル組織培養プレートに播種する。細胞が80～100%コンフルエントになるまで、37 °C、5% CO₂の加湿インキュベーターで培養する。
   2. 感染多重度（MOI）3でMP-12を細胞に感染させる。未感染のウェルを少なくとも2つ用意し、そのうちの1つを未感染コントロールとし、もう1つをアクチノマイシンD（ActD）処理とする。増殖培地を除去し、各ウェルへの添加総量が400 μLになるようにウイルスストックを希釈する。37 °C、5% CO₂の加湿インキュベーターで1時間インキュベートする。
   3. 接種液を除去し、各ウェルに2 mLの新鮮な増殖培地を加える。37 °Cで12時間培養する。

   注意： 本プロトコルを他のウイルスに適用する場合、ラベル化および回収の最適な時点を決定するためにタイムコース実験を行うことが推奨される。感染時間をずらして設定し、すべてのサンプルを同時にラベル化、回収、染色できるようにタイムコースを構築すること。

   4. 感染後12時間（hpi）に、増殖培地を0.5 mM EU含有培地に交換する。擬似感染させたウェルのうち1つに、5 μg/mL ActDを添加する。ActDはDNA依存性RNA合成を阻害するため、これが転写抑制のコントロールとなる。細胞をインキュベーターに戻す。
   5. 感染後13時間に、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を1回洗浄し、トリプシン処理により回収する。回収した細胞を、1 mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）含有PBSで3回洗浄する。

   注意： このステップおよび以降のステップでは、細胞の破壊を防ぐため、500-1,000 x gより速い速度で遠心分離しないこと。細胞を沈殿させるため、1～2分間遠心分離する。

   注意： クリック反応後に表面免疫染色を行う予定の場合は、代わりにラバーポリサーマンまたは使い捨てセルスクレイパーを用いて回収すること。

   6. 細胞を1 mLの4%パラホルムアルデヒド（PFA）に再懸濁して固定し、室温（RT）で30分間インキュベートする。
   7. 各ウェルを1 mL PBS-EDTAで1回洗浄する。直ちにステップ2に進む。

   注意： この段階で長時間放置するとRNAが分解されるため、直ちにクリック反応に進むことが重要である。同様に、タイムコース実験を行う場合は、必ずすべてのサンプルを同時にラベル化、固定、染色すること。

2. ラベル化RNAを検出するためのクリック反応

   1. PBSに溶解した0.2% Triton X-100を1 ml添加して細胞を透過処理する。室温で10分間インキュベートする。

   注意： ステップ2.1から2.3で使用するすべての溶液はヌクレアーゼフリーである必要がある。

   2. 各ウェルを1 ml PBSで3回洗浄する。
   3. 12ウェルプレートからカバーガラスを取り出し、湿室に移す。各カバーガラスに50～100 μlのクリック染色溶液（100 mM Tris pH 8.5, 1 mM CuSO₄, 20 μM 蛍光アジド［最大励起/蛍光波長：590/617 nm］, 100 mM アスコルビン酸）を滴下する。暗所にて室温で1時間インキュベートする。

   注意： 湿室を作成するには、直径10 cmの細胞培養皿またはペトリ皿の底にプラスチックパラフィンフィルムを敷く。皿の縁の内側に湿らせたペーパータオルを沿わせる。プラスチックパラフィンフィルムの上にカバーガラスを置く。

   注意： このステップやその他のステップにおいて、カバーガラスを乾燥させないように注意すること。カバーガラスを湿室に配置した直後に染色溶液を加えるのが最適である。

   注意： クリック染色溶液はこのステップの直前に調製すること。1.5 M Tris pH 8.5、100 mM CuSO₄、500 mM アスコルビン酸のストック溶液は4 °Cで保存可能である。ただし、黄色に変色したアスコルビン酸ストック溶液は廃棄すること。

   注意： 使用する蛍光顕微鏡のフィルターに適合するフルオロフォアを選択すること。

   4. カバーガラスを湿室から取り出して新しい12ウェルプレートに移し、各ウェルを1 ml PBSで3回洗浄する。
   5. 顕微鏡スライド上にFluoromount-Gを1滴（約15 μl）滴下してカバーガラスを封入する。カバーガラスをH₂Oに浸し、側面をペーパータオルに触れさせて余分なH₂Oを除去してから、細胞側を下にしてFluoromount-Gの滴の上に置く。5分間自然乾燥させる。

   注意： 倒立顕微鏡で観察する場合は、Fluoromount-Gを4 °Cで一晩凝固させるか、透明なマニキュアで縁を封止してカバーガラスを顕微鏡スライドに固定すること。

   注意： スライドは直ちに観察するか、暗所4 °Cで最大1週間まで保存可能である。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
5-エチニルウリジン	Berry Associates	PY 7563	DMSOに溶解し100 mMストック溶液とする
12-mm 円形カバーガラス	Fisherbrand	12-545-82
アクチノマイシン D (ActD)	Sigma	9415	DMSOに溶解し10 mMストック溶液とする
蛍光顕微鏡			例：Olympus IX71
CuSO₄	Sigma	C-8027	H₂Oに溶解し100 mMストック溶液とする
DMEM (ダルベッコ改変イーグル培地)	Invitrogen	11965092
FBS (ウシ胎児血清)	Invitrogen	16000044
蛍光アジド (Alexa Fluor 594 結合)	Invitrogen	A10270
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
L-アスコルビン酸	Sigma	A-5960	H₂Oに溶解し500 mMとする
パラホルムアルデヒド	Sigma	158127
ペニシリン-ストレプトマイシン	Invitrogen	15140122
Triton X-100	Sigma	T-8787
トリプシン-EDTA	Invitrogen	25200056
Trizma base	Sigma	T-1503	H₂Oに溶解し1.5 Mストック溶液、pH 8.5とする