This video demonstrates the use of click chemistry and flow cytometry to measure virus-induced suppression of host-cell transcription. Mammalian cells are infected with a virus that expresses a nuclear virulence protein disrupting the host transcription factor complex, while control cells remain transcriptionally active. Incorporation of 5-ethynyl uridine labels newly synthesized mRNA, enabling quantification of transcriptional activity in infected and control cells through dual fluorescence detection.
方法論記事
フローサイトメトリーを用いたウイルス誘発性ホスト転写抑制の解析
9 回視聴
⸱
2026年9月30日
この記事について
要約
プロトコル
1. 細胞をMP-12で感染させ、5-ethynyluridine (EU)を用いて新生RNAを標識する
- 293細胞を増殖培地（10%胎児牛血清、100 U/ml ペニシリン、100 μg/ml ストレプトマイシンを含むDMEM）を用いて6ウェル組織培養プレートに播種する。細胞が80 - 100%コンフルエントになるまで、37 °C、5% CO2の加温加湿インキュベーターで培養する。
- m.o.i. 3でMP-12を細胞に感染させる。未感染のウェルを少なくとも2つ用意する。そのうち1つのウェルは未感染コントロールとし、もう1つのウェルはステップ1.4でActD処理を行う。増殖培地を除去し、各ウェルへの添加合計量が400 μlとなるようにウイルスストックを希釈する。37 °C、5% CO2の加温加湿インキュベーターで1時間インキュベートする。
- 接種液を除去し、1ウェルあたり2 mlの新鮮な増殖培地を加える。37 °Cで12時間インキュベートする。
注意：本プロトコルを他のウイルスに応用する場合は、ラベリングおよび回収の最適な時点を決定するために、タイムコース実験を行うことが推奨されます。このタイムコース実験を行う際は、感染させる時間をずらして設定し、すべてのサンプルを同時にラベリング、回収、および染色できるようにしてください。
- 感染後12時間（12 h.p.i.）で、増殖培地を0.5 mM EUを含む培地に交換する。模擬感染（mock infected）させたウェルのうち1つに、5 μg/ml ActDも添加する。ActDはDNA依存性RNA合成を阻害するため、これを転写抑制のコントロールとする。その後、細胞をインキュベーターに戻す。
- 感染後13時間（13 h.p.i.）で、細胞をPBSで1回洗浄し、トリプシン処理により回収する。回収した細胞を、1 mM EDTAを含むPBS（PBS-EDTA）で3回洗浄する。
注意： このステップおよび以降のステップでは、細胞の破壊を防ぐため、500 - 1,000 x g より速い速度で細胞を遠心分離しないでください。細胞を沈降させるために1-2分間遠心分離します。
注意：クリック反応後に表面免疫染色の実施を予定している場合は、代わりにラバーポリシーマンまたは使い捨てセルスクレーパーを使用して回収してください。
- 細胞を 4% PFA 1 ml に再懸濁して固定し、RT で 30 分間インキュベートする。
- 1ウェルあたり 1 ml の PBS-EDTA で 1 回洗浄する。直ちにステップ 6 へ進む。
注意： RNAはこの段階で長時間放置すると分解するため、速やかにクリック反応に進むことが重要です。同様に、タイムコース実験を行う場合は、必ずすべてのサンプルのラベル付け、固定、染色を同時に行ってください。
2. ラベル化RNAを検出するためのクリック反応
- PBSで希釈した0.2% Triton X-100を0.5 ml加え、細胞を再懸濁して透過処理を行う。室温で10分間インキュベートする。
注記： ステップ2.1から2.3で使用するすべての溶液は、ヌクレアーゼフリーである必要があります。このステップで細胞が適切に沈降しない場合は、遠心分離時間を5分に延長してください。細胞をFACSバッファーに懸濁させると、沈降挙動が改善されます。
- 1 mlのPBSで1回洗浄する。
注意： このステップでは、クリック反応に必要なCu²⁺イオンをキレートしてしまうため、EDTAを使用しないでください。
- 200 μlのクリック染色溶液（100 mM Tris pH 8.5, 1 mM CuSO4, 蛍光色素標識アジド [最大励起/蛍光波長: 650/665 nm] 200nM, 100 mM アスコルビン酸）で細胞を再懸濁する。室温、暗所で1時間インキュベートする。
注記： クリック染色溶液は、このステップの直前に調製してください。1.5 M Tris pH 8.5、100 mM CuSO4、および 500 mM アスコルビン酸のストック溶液は 4 °C で保存可能です。ただし、黄色に変色したアスコルビン酸ストック溶液は廃棄してください。このステップで細胞が凝集した場合は、ピペッティングを数回繰り返して再懸濁してください。使用するフローサイトメーターで検出可能な蛍光色素を選択してください。また、クリック染色手順を行わない感染細胞のサンプルを1つ用意してください。これはフローサイトメーターのキャリブレーションに必要となります。感染細胞の半分を使用するか、ステップ 1.2 で感染細胞のウェルを追加してください。
FACSバッファー（1 mM EDTAおよび0.5% (w/v) BSAを含むPBS）で2回洗浄します。
3. ウイルス蛋白質の発現を検出するための免疫蛍光染色
- FACSバッファーで希釈した一次抗体（anti-RVFV、1:10,000）200 μlに細胞を再懸濁し、室温・暗所で1時間インキュベートする。
注： あるいは、このステップは4 °Cの暗所で一晩（O/N）で行うことも可能です。
注意： また、クリック染色手順を行うが免疫染色は行わない、非感染細胞のサンプルを1つ用意してください。これはフローサイトメーターのキャリブレーションに使用します。模擬感染細胞の半分を使用するか、ステップ1.2で非感染のウェルを追加してください。
注意： このプロトコルを別のウイルスに適用する場合は、まず一次抗体の最適な希釈倍率を決定してください。
- FACSバッファーで細胞を2回洗浄する。
- FACSバッファーで希釈した（1:1,000）二次抗体（蛍光色素結合抗マウスIgG［最大励起/蛍光波長：495/519 nm］）200 μlに細胞を再懸濁し、室温・暗所で1時間インキュベートする。
- FACSバッファーで細胞を1回洗浄する。
注意： この時点で、細胞を 4 °C の暗所で一晩（O/N）保存することが可能です。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 5-エチニルウリジン | Berry Associates | PY 7563 | DMSOに溶解して100 mMストック溶液を調製 |
| 12 mm ラウンドカバーガラス | Fisherbrand | 12-545-82 | |
| 5 ml ポリスチレンチューブ | BD Biosciences | 352058 | |
| アクチノマイシン D (ActD) | Sigma | 9415 | DMSOに溶解して10 mMストック溶液を調製 |
| Alexa Fluor 488 山羊抗マウスIgG | Invitrogen | A-11029 | |
| ウシ血清アルブミン (BSA) | Santa Cruz | sc-2323 | |
| CuSO₄ | Sigma | C-8027 | H2Oに溶解して100 mMストック溶液を調製 |
| DAPI | Sigma | D-9542 | H2Oに溶解して5 mg/mlストック溶液を調製 |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | |
| 蛍光アジド (Alexa Fluor 594結合) | Invitrogen | A10270 | |
| 蛍光アジド (Alexa Fluor 657結合) | Invitrogen | A10277 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| L-アスコルビン酸 | Sigma | A-5960 | H2Oに溶解して500 mMに調製 |
| ろ紙 | VWRbrand | 28333-087 | |
| パラホルムアルデヒド | Sigma | 158127 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | Invitrogen | 15140122 | |
| poly-L-リシン (MW ≥ 70000) | Sigma | P1274 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Trizma base | Sigma | T-1503 | H2Oに溶解して1.5 Mストック溶液を調製、pH 8.5 |
| トリプシン-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| 蛍光顕微鏡 | 例：Olympus IX71 | ||
| フローサイトメーター | 例：BD Biosciences LSRII Fortessa |
