レトロウイルスの作製 Bosc23細胞の単細胞懸濁液（6 × 10⁶）を16 cmペトリ皿に播種し、10% FBS（胎児牛血清）含有DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）18 mLで、コンフルエンシーが80%に達するまで（24時間）培養する。注：細胞は単層で増殖させ、培養中に凝集させないこと。細胞計数はさまざまな方法で実施可能である（本資料で提示する以降のプロトコルでも同様である）。サンプル数が少ない場合は、Bürkerチャンバーを用いた顕微鏡下での手動計数を推奨する。この場合、死細胞を除外するためにトリパンブルーを使用する。細胞をPBS（リン酸緩衝生理食塩水）中の0.4%トリパンブルーと1:1で混合する。大量のサンプルを計数する場合は、自動細胞カウンターを使用できる。 40 µgのレトロウイルス構築物（MSCVなど）、20 µgのpCL-Eco（パッケージングベクター）、80 µlのPEI（ポリエチレンイミン）、および2 mLの低血清培地（例：抗生物質なしのOpti-MEM（Minimum Essential Medium））を混合する。この混合液を室温（RT）で20分間インキュベートする。 Bosc23細胞の培地を、2% FBSを添加した16 mLのDMEMに慎重に交換する。培地は使用前に37 °Cに予熱しておく。注：抗生物質はトランスフェクション効率を低下させる可能性があるため、トランスフェクション中は使用しないこと。 1.2で調製した混合液をBosc23培養液に慎重に滴下して加え、37 °Cで4時間インキュベートする。PEIの毒性があるため、インキュベーションは6時間未満に留めること。 インキュベーション後、Bosc23の培地を10% FBS含有の予熱済みDMEM 18 mLに交換し、37 °Cで48時間培養する。皿はバイオセーフティレベル2の研究室に設置し、標準的な安全手順に従うこと。 エコトロピック・レトロウイルス粒子を含むBosc23培地を、25 mLセロロジカルピペットを用いて50 mLコニカルチューブに回収し、4 °Cで保存する。注：（重要）高タイターのウイルスを産生するには、トランスフェクション効率が90%に達する必要がある。 Bosc23細胞に10% FBS含有の予熱済みDMEM 18 mLを加え、24時間培養する。 ステップ1.6を繰り返す。注：ウイルスの完全性を維持するため、1.6および1.8で得られたレトロウイルス上清は、同じ温度（4 °C）になってからプールすることができる。 ウイルス上清へのBosc23細胞の混入を避けるため、回収したウイルスを4 °C、1500 × gで10分間遠心分離する。ウイルスを分注し、ドライアイスまたは液体窒素を用いて急速凍結させ、-80 °Cで保存する。ただし、感染効率の面では、凍結保存株よりも調製直後のウイルスの方が品質が高いことに留意すること。注：（重要）ウイルスの劣化を招くため、繰り返しの凍結融解は避けること。 Zjablovskaja, P., et al.マウス骨髄前駆細胞32D/G-CSF-Rの増殖と分化。 J. Vis. Exp. (2018)
このビデオでは、ヒト腎由来のパッケージング細胞にトランスフェクションを行い、組み換えレトロウイルス粒子を産生する方法を実演します。これにより、遺伝子改変、機能解析、または細胞系統の分化研究などのダウンストリームアプリケーションに向けて、標的細胞への安定した遺伝子導入が可能になります。
