感染性呼吸器合胞体ウイルス定量のためのプラーク滴定法

要約

出典: Bouillier, C., et al. 重換え型呼吸器細胞融合症ウイルスの作製、増幅およびタイター測定。 J. Vis. Exp. (2019)

このビデオでは、上皮細胞単層における感染性組換え呼吸器合胞体ウイルス（RSV）を定量するために用いられるプラーク滴定法について解説します。ここでは、段階希釈したウイルス懸濁液による宿主細胞への感染、セルロースベースの半凝固オーバーレイによるウイルスの拡散制限、および細胞変性効果による局所的なプラークの形成について示します。一連の手順は、ウイルス力価を決定しRSVの感染性を評価するための染色、除染、およびプラークのカウントで締めくくられます。

プロトコル

1. プラーク滴定法

1. タイトレーションアッセイを実施する前日に、タイトレーション用の12ウェルプレートを準備します（ウイルス1本をタイトレーションするのに6ウェル必要です）。各ウェルに、5×10^5 cells/mLの濃度でHuman epithelial type-2（HEp-2）細胞を1 mLずつ播種します。 × 10⁵ 完全培地中のcells/mL
2. 翌日、滅菌した微結晶セルロース懸濁液（水中で2.4% [w/v]）（材料表を参照）を調製する。
   1. 2.4 gの結晶セルロース粉末を100 mLの蒸留水に分散させ、標準的なマグネチックスターラーを用いて、粉末が完全に溶解するまで攪拌する（通常4～12時間）。この懸濁液をオートクレーブで処理する。 121 °C 20分間放置し、使用前まで室温で保存する。
      注： このような条件下では、懸濁液は1年間安定です。
   2. 滅菌環境下で溶液を開封した後、以下に保存してください。 4 °C 6か月間保存してください。均質であることを確認するため、使用前には必ず（手で振るかボルテックスミキサーを用いて）懸濁液を混合してください。
3. 2を準備します。× 滅菌環境下での最小必須培地（MEM）。市販のMEMを10倍に希釈し× 滅菌水で希釈し、L-グルタミン、1,000 units/mLのペニシリン、および1 mg/mLのストレプトマイシンを添加する。希釈液を激しく振盪し、以下で保存する。 4 °C.
   注： クラスII安全キャビネットを使用し、無菌環境下でステップ1.4〜1.10を行ってください。
4. 以下のものを入れた6本のチューブを準備します。 900 µL ウイルスのタイターを測定するチューブ（タイトレーションチューブ）1本につき、胎児牛血清（FCS）を含まないMEMを分注する。ウイルスの分注液を融解し、5秒間激しくボルテックスした後、移送する。 100 µL 最初のタイトレーションチューブに。
5. 10倍希釈を6回行う×、以下の通りである。添加し 100 μL ウイルスの 900 μL 最初のチューブに培地を加え、チューブにキャップをして、数秒間ボルテックスミキサーで撹拌する。ピペットのチップを交換し、次に 100 µL 最初の希釈段階から 900 µL 2本目のチューブに培地を加え、キャップを閉めてボルテックスミキサーで撹拌する。この操作を6本目のチューブまで繰り返す。
   注： 希釈のたびにチップを交換することが非常に重要です。
6. HEp-2 12ウェルプレートにウイルス名と希釈倍数を記入してください。染色工程（ステップ1.9）の際にプレートと蓋が離れる可能性があるため、それぞれが一致するように印を付けてください。プレートから培地を除去し、分注します。 400 µL 1ウェルあたり1つの希釈系列を用います。プレートを以下の条件でインキュベートします。 37 °C ウイルス吸着のため、2時間。
   注意： 接種ごとにピペットチップを交換するか、同一のチップを使用して低濃度から高濃度の順に接種してください。細胞の乾燥を防ぐため、少数のプレート（1〜2枚）を同時に接種してください。
7. ウイルスの吸着が行われている間に、微結晶セルロースオーバーレイを調製してください（直前調製）。オーバーレイ100 mLを得るには、2.4%微結晶セルロース懸濁液10 mLと、2%× MEM、および2% FCS含有MEM 80 mL。
   1. 2のpHを調整します。× カラーインジケーターに従い、7.5%滅菌重曹（炭酸水素ナトリウム）溶液を用いてMEMのpHを約7.2に調整する。微結晶セルロース懸濁液とMEMを加え、激しく混合する。
8. 2時間のインキュベーション終了後、接種物を除去せずに、12ウェルプレートの各ウェルに2〜3 mLのオーバーレイを添加する。ウイルス力価の高い接種物によって隣接するウェルを汚染しないよう注意すること。プレートを以下でインキュベートする。 37 °C および5% CO₂₂ 6日間。インキュベーション中は、プレートおよびインキュベーターを移動させないでください。
9. クリスタルバイオレット溶液（水にクリスタルバイオレット 8% [v/v]、ホルムアルデヒド 2% [v/v]、エタノール 20% [v/v]）を用いて、細胞の染色を行う。
   1. バイオセーフティキャビネットの作業面をシートで保護してください（クリスタルバイオレットは表面を強く染色するため）。
   2. プレートを静かに揺らして、微結晶セルロースのオーバーレイを除去する。上清を取り除き、細胞を2回洗浄する。× 1と共に× リン酸緩衝生理食塩水（PBS）。細胞の乾燥を防ぐため、プレートは1枚ずつ処理する。クリスタルバイオレット溶液を1〜2 mL加え、10〜15分間待機する。溶液を除去する。この溶液は、後続のプレートの染色に再利用可能である。
   3. プレートと蓋を新しい漂白剤に数秒間浸し、その後、水道水で十分に洗浄してください。プレートと蓋は漂白剤によって除染されることに注意してください。
   4. プレートと蓋をペーパータオルの上に置き、乾燥させる。水洗後、プレートを室温で乾燥させ、そのまま室温で保存する。長期保存（数ヶ月）の場合は、色褪せを防ぐため、プレートを遮光して保管すること。なお、細胞の色が消えた場合は、クリスタルバイオレットで再度染色することが可能である。
10. ウイルス力価を算出する。乾燥したプレートのウェル内で、肉眼で確認できるプラーク数をカウントする。異なる希釈段階におけるプラーク数が整合していること（各希釈間で10倍の係数であること）を確認する。プラークが最も数えやすいウェルを選択する。接種量および希釈倍率に対するプラーク数を評価する。
    注： 提供された例では、 図1、10倍希釈において21個のプラークが計数される^-5 希釈。これは、以下のタイターに相当します。

結果

図1：プラークアッセイを用いたRSVタイターの決定。 (A) 12ウェルプレートにおけるプラークタイター測定の結果。1つのウイルスストックを段階希釈して感染させた6つのウェルを示す。希釈倍率は常用対数で表記している。最初の3つの希釈倍数で感染させた細胞はすべて剥離している。10^-4、10^-5、10^-6の希釈で観察されたプラーク数は一致している。(B) プラーク計数の例示（黄色の数字）。緑色の星印は細胞層の擦り傷を示す。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
クリスタルバイオレット溶液	Sigma	HT90132
HEp-2	ATCC	ATCC CCL-23
MEM (10x)、グルタミン不含	ThermoFisher Scientific	11430030
MEM、GlutaMAXサプリメント	ThermoFisher Scientific	41090-028
重炭酸ナトリウム 7.5% 溶液	ThermoFisher Scientific	25080094
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122