細胞培養上清中の逆転写酵素（RT）の分析 放射性物質を使用するため、バイオセーフティレベル3（BSL-3）施設内の生物学的安全キャビネットを準備する。キャビネット内に吸収紙を敷き、アスピレーターを放射性物質専用のものに交換する。注：すべての放射性廃棄物は、安全規定に従って適切に廃棄しなければならない。RTマスターミックスの1 ml分注量ごとに、10 mCi/ml [α-33P]デオキシチミジン三リン酸（dTTP）を1～2 µl、および1 Mジチオスレイトール（DTT）を4 µl添加する（表1参照）。RTマスターミックス、DTT、および[α-33P] dTTPが入った各1.5 mlマイクロ遠心チューブを1,000 µlピペットで慎重に混合し、滅菌済みのトラフに移す。ラベル化されたRTミックスを25 µlずつ、96ウェル薄壁ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）プレートの各ウェルに分注する。注：陽性対照（MJ4野生型（WT）感染）および陰性対照（擬似感染）用のスペースを確保しておく。RTマスターミックスを含むPCRプレートに、各上清を5 µlずつ添加する。PCRプレートを粘着アルミホイルカバーで密閉し、サーモサイクラーを用いて37 °Cで2時間インキュベートする。安全のため、ピペットチップをAmphylで洗浄し、Amphyl廃棄物用の小型容器に廃棄する。この容器は後に放射性廃棄物として処理される。インキュベート後、200 µlマルチチャンネルピペットを用いてホイルカバーに小さな穴を開ける。注：ピペットチップがウェル内の液体に触れた場合は、次の列または行に移動する前にチップを交換すること。サンプルを5回混合し、各サンプルを5 µlずつDE-81紙に移す。10分間風乾させる。ブロットを1x塩化ナトリウム-クエン酸ナトリウム（SSC）で5回洗浄し、次いで90%エタノールで1回5分間、2回洗浄する。その後、風乾させる。各ブロットをサンドイッチストレージボックスなどの個別の洗浄容器に入れ、ブロットが浸かる十分な量の洗浄バッファー（1x SSCまたは90%エタノール（EtOH））を加え、5分間振盪する。洗浄バッファーを別の容器に注ぎ捨て、この操作を繰り返す。注：最初の3回の洗浄液は放射性物質を含むものとして適切に廃棄すること。最後の2回の洗浄液は通常通りに廃棄できる。乾燥後、ブロットをサランラップで慎重に包み、密閉カセット内でフォスロスクリーンに密着させ、室温で一晩露光する。フォスロイメージャーを用いてフォスロスクリーンを解析し、放射性転写産物を定量する。OptiQuantソフトウェアを使用して、各放射性シグナルを円で囲む。デジタル光単位（DLU）値をグラフ化し、複製曲線を生成する。複製能力スコアを算出するため、DLU値をlog10変換し、2日目、4日目、および6日目のタイムポイントを用いて傾きを算出した。その後、複製傾きをWT MJ4の傾きで除し、複製能力スコアを算出した。アッセイ内変動を抑えるため、同一のRTプレートから得られたMJ4 WTの値に基づいて正規化することが重要である。 表1：放射性標識逆転写酵素アッセイ用マスターミックスの処方 注：-20 °Cで1 mlずつ分注して保存すること。 試薬 | 容量 (ml) --- | --- ヌクレアーゼフリーH2O | 419.5 Tris-Cl, pH 7.8 (1 M) | 30 塩化カリウム (1 M) | 37.5 塩化マグネシウム (1 M) | 2.5 Nonidet P-40 (10%) | 5 EDTA (0.5 M) | 1.02 ポリアデニル酸カリウム塩 (2 mg/ml) | 1.25 Oligo-dTプライマー (25 μg/ml) | 3.25 合計容量 | 500 Claiborne, D. T. 他 制限酵素を用いた、～を評価するためのクローニング法 in vitro HIV-1サブタイプC Gag-MJ4キメラウイルスの複製能力 J. Vis. Exp. (2014)
このビデオでは、放射標識逆転写酵素アッセイを用いたウイルス複製能の評価方法を解説します。子ウイルス粒子を含む培養上清を、放射標識ヌクレオチドを含む逆転写反応混合液に添加します。取り込まれたシグナルは、ウイルスの産生量と複製効率を反映します。フォスホリメイジャーを用いて、試験サンプルと野生型サンプルのシグナルを検出および比較します。
