1. サンプルの調製 タイトレーション用のルシフェラーゼ発現ウイルス（ここでは例としてVSV∆51-Fluc）を含むサンプルを入手し、96ウェルプレートに分注する。あるいは、96ウェル組織培養プレートで感染を行い、上清を直接使用する。 標準曲線を記入するため、2列分は未処理のままにしておく。96ウェルプレートで直接実験を行う場合は、実験終了時（感染後40時間）にタイトレーションを行うか、-80 °Cで保存して後日にタイトレーションを行う。 2. ウイルスタイトレーション用許容細胞の調製 タイトレーションの24時間前に、10%胎児牛血清（FBS）、30 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）、および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDulbecco's modified eagle medium（DMEM）中で、2.5 x 10⁵ cells/mlの濃度でVero細胞の懸濁液を調製する。注：本プロトコルではVero細胞を使用しているが、水疱性口炎ウイルス（VSV）感染に適した任意の許容細胞株を使用することが可能である。 マイクロプレートディスペンサーを用いて、96ウェル白色不透明底平底プレートに2.5 x 10⁴ cells（100 μl）を播種する。 プレート1枚あたり12 mlの細胞懸濁液を調製し、さらにプライミング用に5 mlを追加する。 滅菌水50 mlでチューブをフラッシングし、マイクロプレートディスペンサーのカセットを洗浄する。 マイクロプレートディスペンサーのラインに細胞懸濁液を満たし、5 mlの細胞懸濁液を流す。 白色壁の96ウェルプレートの各ウェルに100 μlを分注するプログラムを選択する。分注を行い、追加のプレートが必要な場合は必要に応じて繰り返す。また、不透明底の白色壁プレートを使用する場合は、細胞の状態と密度を確認するため、96ウェル透明底平底プレートの数ウェルにも播種する。 完了後、細胞を元の容器にフラッシングして戻す。チューブに70%エタノール50 mlを流し、続いて温めた滅菌水50 mlを流してカセットを洗浄する。 使用ごとにカセットとチューブが適切に洗浄されていることを確認すること。 加湿5% CO₂インキュベーター中、37 °Cで24時間細胞を培養する。 3. ウイルス標準曲線の調製 Vero細胞に転移させた後の1 mlあたりのプラーク形成単位（pfu）の最終濃度が、10⁸ pfu/ml、10⁷ pfu/ml, 10⁶ pfu/ml, 10⁵ pfu/ml, 10⁴ pfu/ml, 10³ pfu/ml, 10² pfu/ml, および 10¹ pfu/mlとなるように、無血清DMEMでVSV∆51-Flucの標準曲線を調製する。Vero細胞のプレート1枚につき、各濃度の溶液を50 μl（＋予備10%）調製する。 注：絶対定量を可能にする標準曲線を作成するには、古典的な手法でルシフェラーゼウイルスストックのタイターを評価する必要がある。それ以外の場合、希釈段階に基づいてウイルスタイターを任意に設定することで、正確なタイター情報なしに相対定量を行うことができる。例えば、標準曲線の最初の希釈を10⁸ウイルス単位とし、続く1/10希釈を10⁷とする。この場合、絶対定量は正確ではないため、あらかじめ決定したサンプルに対する倍率変化として値を表すべきである。 4. 許容細胞へのサンプル上清の転移 透明底96ウェルプレートに播種したVero細胞を光学顕微鏡で観察し、単層が少なくとも95%コンフルエントであることを確認する。 白色壁プレートに播種したVero細胞に、サンプル上清25 μlを転移する。標準曲線用に指定した2列には上清を転移させない。注：これは96チャンネル液体ハンドラーを用いて、1枚のプレートの全ウェルで同時に行うことができる。 8チャンネルまたは12チャンネルのマルチチャンネルピペッターを用いて、ステップ3で調製した標準曲線の各希釈液25 μlを、指定された2列のVero細胞に加える。 室温（RT）にて、430 x gで5分間プレートを遠心分離する。 加湿5% CO₂インキュベーター中、37 °Cで5時間培養する。 Garcia, V., 他ルシフェラーゼ発現組換えウイルスのハイスループットタイター測定。J. Vis. Exp. (91), e51890, doi:10.3791/51890 (2014).
このビデオでは、ルシフェラーゼベースのアッセイを用いてウイルス量を評価するための細胞培養サンプルの調製方法を実演します。遺伝子改変ウイルスを用いて上皮細胞に感染させ、ウイルスの含有上清および標準試料をアッセイウェルに転移し、遠心分離とインキュベーションによってウイルスの侵入を促進させるプロセスについて概説します。ルシフェラーゼの発現をレポーターとして利用することで、発光シグナルの出力に基づいてウイルス濃度を定量することが可能です。
