1. マウス胚性幹細胞（mESC）へのレンチウイルスの感染 低継代（継代数35未満）のフィーダーフリー適応クロマチンin vivoアッセイ（CiA）mESCを、20% ESCグレード胎児牛血清（FBS）、10 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）、1x 非必須アミノ酸（NEAA）、ペニシリン/ストレプトマイシン、2-メルカプトエタノール、および1:500の白血病阻止因子（LIF）を添加した高グルコースDulbecco's Modified Eagle medium（DMEM）ベース培地を用い、37 °C、5% CO2インキュベーター内で培養する。 注：LIFは、Lif-1C-alphaを産生するCos細胞（COS LIF）の培養上清から得たものであり、バッチごとに回収し-80 °Cで凍結保存したものを使用する。 1x リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の0.1%ゼラチンで1～3時間前培養し、その後1x PBSで洗浄したプレート上で細胞を培養する。細胞には毎日培地を供給し、密度に応じて2～3日ごとに継代する。 注：形態学的に、胚性幹細胞（ES）コロニーは小さく円形であり、互いに独立している必要がある。 感染の1日前に、mESCを12ウェルプレート（100,000個/ウェル）に播種する。 ヘモサイトメーターで細胞数を計測する。10 cmディッシュで培養した細胞の場合、古い培地を吸引除去し、1x PBSを5 mL加え、PBSを吸引除去した後、0.25%トリプシンを1 mL加える。トリプシン中で37 °Cで8分間インキュベートし、途中でプレートを揺らしたり叩いたりして細胞を剥離させる。この工程の目的は、細胞を単一細胞懸濁液にすることである。 15 cmプレートの293Tヒト胚性腎（HEK）細胞の培地交換から48時間後、上清を除去して50 mLコニカルチューブに移す。 上清を300 x gで5分間遠心分離し、細胞残渣をペレット化する。 上清を0.45 µmメンブレンでろ過する。 注：他の材質ではウイルスが保持され収量が著しく低下する場合があるため、必ず界面活性剤フリーセルロースアセテート（SFCA）メンブレンを使用すること。 SW32ローターを備えた遠心機を用い、4 °Cで20,000 rpm（約72,000 x g）で2.5時間回転させ、超遠心分離によりウイルスを濃縮する。 超遠心分離でウイルスを濃縮している間に、12ウェルプレート内のCiA mESCを、5 µg/mLのポリブレンを含む新鮮なES培地で処理する。 ウイルスの濃縮が完了したら、上清を慎重に吸引し、ウイルスペレットを100 µLの1x PBSに懸濁させる（気泡が入りすぎないように注意する）。 ウイルスと1x PBSを1.5 mLマイクロチューブに加える。チューブを300 x g（または最低設定）でボルテックスまたは振盪し、ウイルスを完全に懸濁させる。ミニ卓上遠心機で5～10秒間スピンダウンし、気泡を除去する。 12ウェルプレートの各ウェルにウイルスを30 µLずつ加える。プレートを円を描くように揺らした後、1,000 x gで20分間遠心分離する。 注：添加するウイルスの量は、デリバリー構築物のサイズに反比例するウイルスタイターに応じて調整可能である。 あるいは、ウイルスを液体窒素で急速凍結し、-80 °Cで保存することも可能である。ただし、凍結によりウイルスタイターは低下する。 12ウェルプレートを37 °Cインキュベーターに戻し、翌朝（約16時間後）に新鮮なES培地で培地交換を行う。 感染から48時間後、適切な抗生物質（例：1.5 µg/mL プロマイシン、10 µg/mL ブラスチサイジンなど）を添加し、ウイルスプラスミドが組み込まれた細胞を選択する。毎日培地を交換し、大部分の細胞が浮遊または死滅している場合は、1x PBSで細胞を洗浄する。選択培地を入れたまま、37 °C、5% CO2インキュベーター内で72～96時間保持する。 キアレッラ, A. M. 他、 化学的エピジェネティック修飾剤による細胞内装置の再誘導を用いた遺伝子転写の抑制 J. Vis. Exp. (2018)
このビデオでは、レンチウイルス導入を用いた遺伝子改変マウス胚性幹細胞の作製方法を解説します。レンチウイルス粒子によって抗生物質耐性マーカーを導入することで、安定したゲノムへの組み込みと、導入細胞の選択が可能になります。
