1. Nicotiana benthamiana 植物へのウイルス接種および VLP の精製 Ambion 社の T7-mMessage mMachine Kit を使用し、トウモロコシ線状葉枯病ウイルス（MRFV）の野生型（wt）およびシステイン変異型外殻タンパク質（CP）遺伝子を組み込んだ Potato virus X（PVX）ベースのベクタープラスミドから、キャップ付き T7-RNA 転写物を調製する。 各 T7 転写反応につき、N. benthamiana の十分に展開した 2 枚の葉に 10 μL の反応液を接種し、温室にて 10 日間培養する。条件は、湿度 60%、25 °C で 16 時間の明期（25,000～30,000 lux）、20 °C で 8 時間の暗期とする。 接種後 10 日（dpi）に N. benthamiana のウイルス感染葉を収穫し、植物組織を計量（50 g）して氷上に置く。 冷却した 0.5 M クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 5.5）100 mL（植物組織 1 g あたり 2 mL の緩衝液を使用）の存在下で、ブレンダーを用いて植物材料をホモジナイズする。 ホモジネートを 3 層のチーズクロスでろ過し、27,000 × g で 30 分間遠心分離して清澄化する。上清を冷却したメスシリンダーに移して体積を測定し、その後、冷却した滅菌ビーカーに移す。ペレットは廃棄する。 上清に 10% ポリエチレングリコール 8,000（PEG 8,000）を加え、4 °C で 15 分間撹拌した後、さらに 4 °C で 45 分間インキュベートして、ウイルス様粒子（VLP）-PEG マトリックスを沈殿させる。 試料を 4 °C、27,000 × g で 20 分間遠心分離し、上清を除去する。 ペレットに 2% Triton X-100 を含む 0.05 M クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 5.5）8 mL を加える。遠心チューブを十分に回転させてペレットを懸濁させる。ペレットと緩衝液を冷却した滅菌ビーカーに移す。直ちにチューブを同緩衝液 2 mL で洗浄し、ビーカーに加える。ペレットが溶解するまで（通常 1 時間）、4 °C で懸濁液を撹拌する。 27,000 × g で 5 分間遠心分離して清澄化し、ペレットを廃棄する。上清を 4 °C、140,000 × g で 2 時間遠心分離する。 ペレットを 1 mL の 0.05 M クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 5.5）で再懸濁し、0.05 M クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 5.5）で作製した 10～40% ショ糖密度勾配の上層に懸濁液を載せる。 密度勾配を 4 °C、140,000 × g で 3 時間遠心分離する。 遠心チューブの上部から光を照射し、チューブ上端から 4 cm の位置にある光散乱の上部バンドを回収し、0.05 M クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 5.5）で希釈して、4 °C、140,000 × g で 3 時間遠心分離する。 ペレットを 0.5 mL の滅菌水で再懸濁し、4 °C で最大 6 ヶ月間保存する。 ブラッドフォード法によるタンパク質定量を行い、VLP 濃度を定量する。VLP の収量は植物組織 1 g あたり 1～3 μg である。 2. VLP のフルオレセイン-5-マレイミド標識反応 50 mM リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.0）、1 mM エチレンジアミン四酢酸（EDTA）に、フルオレセイン-5-マレイミド（427.37 g/mol）を溶解させ、1 mM 溶液を調製する。ボルテックスで混合し、完全に溶解していることを確認する。チューブはアルミホイルで遮光する。 ステップ 1 で調製した VLP にフルオレセイン-5-マレイミドを加え、混合する。フルオレセイン-5-マレイミドのモル量は、スルフィドリル基のモル量に対して 25 倍過量とする。通常、濃度 1 μg/μL の VLP 30 μL とフルオレセイン-5-マレイミド溶液 60 μL を使用することで、良好な結果が得られる。 反応液を室温で 2 時間、または 4 °C で一晩インキュベートする。 最終濃度 50 mM となるようにジチオスレイトール（DTT）を加え、反応を停止させる。 未反応のフルオレセインを、脱塩スピンカラム（Thermo Scientific Inc., Rockford IL）を用い、室温、1,500 × g で 2 分間遠心分離して除去する。 SDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動）分析用には、各反応液 10 μL に 2 × SDS-PAGE Laemmli サンプルバッファー 10 μL を加える。標識タンパク質は遮光し、4 °C で最大 1 ヶ月間、または -20 °C で分注して最大 3 ヶ月間保存する。 Natilla, A., および Hammond, R. W. Nicotiana benthamiana植物で産生させたトウモロコシレイアド・フィノウイルスウイルス様粒子のシステイン残基の溶媒接近性の解析およびペプチドのVLPへの架橋。 J. Vis. Exp. (2013)
このビデオでは、チオール反応性染料を用いて、Nicotiana benthamianaで産生させた変異ウイルス様粒子（VLP）の部位特異的な蛍光標識を行い、それに続く精製とゲル電気泳動によって表面修飾を確認する方法を実演します。
