ジスルフィド再架橋によるウイルス様粒子の蛍光機能化

要約

出典：Chen, Z., et al. Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry. J. Vis. Exp. (2018)

このビデオでは、還元されたジスルフィドをポリエチレングリコール（PEG）リンカーで再架橋することにより、ウイルス様粒子を蛍光機能化する方法を実演します。これにより、生物医学的応用における細胞イメージングや標的輸送に適した、安定で追跡可能なコンジュゲートが作製されます。

プロトコル

1. バクテリオファージQβへのジブロモマレイミド（DB）化合物の接合

1. Qβのジスルフィド結合を還元する。
   1. 0.0020 gのtris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)を1 mLの超純水に溶解し、100xストック溶液を作成する。
      注記：還元の直前にTCEPを調製すること。
   2. マイクロ遠心チューブに200 µLのQβ (5 mg/mL)を入れる。
   3. 続いて、20 µLの100x TCEPストック溶液を加える。
   4. 室温で1時間インキュベートする。
2. ジブロモマレイミドポリエチレングリコール (DB-PEG)を用いて、還元されたジスルフィド結合を再架橋する。
   1. 0.0017 gのdibromomaleimide-polyethylene glycol (DB-PEG)を100 µLのDMFに溶解する。
   2. 680 µLの10 mMリン酸ナトリウム溶液 (pH 5)を加える。
   3. DB-PEG溶液に還元したQβを加え、365 nmのUV（紫外線）ランプ下で混合過程を観察する。混合後、365 nmの手持ち式UVランプを用いて、明るい黄色の蛍光を直ちに視認できる。
   4. ロティセーターを用いて、室温 (RT)で一晩反応させる。
3. 反応混合物を、遠心フィルター (分画分子量 (MWCO) = 10 kDa)を用い、1x PBS (リン酸緩衝生理食塩水)を使用して 3,283 x g、4 °Cで20分間、3回精製する。
4. 非還元SDS-PAGE (ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動)およびネイティブアガロースゲル電気泳動により、接合を確認する。
   注記：VLP (ウイルス様粒子)は、ネイティブアガロースゲル中では完全な粒子として泳動され、その電荷、サイズ、および形状に基づいて分離される。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2,3-ジブロモマレイミド 97%	Sigma Aldrich	553603-5G
ポリエチレングリコール	Alfa Aesar	41561-22
リン酸ナトリウム	Fisher Scientific	AC424375000
アクリルアミド/ビス-アクリルアミド	P212121	RP-A11310-500.0
ドデシル硫酸ナトリウム	Sigma Aldrich	L3771-100G
過硫酸アンモニウム	Fisher Scientific	BP179-100
Amicon Ultra-4遠心式フィルターユニット	Millipore Sigma	UFC801024
Falcon 15 mL 円錐型遠心チューブ	Fisher Scientific	14-959-53A
マイクロ遠心チューブ: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-129
VWR Os-500 オービタルシェーカー	VWR Scientifc Products	14005-830
P1000 Pipetman	Gilson	F123602
P200 Pipetman	Gilson	F123601
P100 Pipetman	Gilson	F123615
P20 Pipetman	Gilson	F123600
P10 Pipetman	Gilson	F144802
Intel Weighing PM-100 ラボラトリークラシック高精度分析天秤	Intelligent Weighting Technology	IWT_PM100