透過電子顕微鏡観察のための安全なウイルス検体調製法

要約

出典：Blancett, C. D., 他バイオコンテインメント内におけるウイルス試料のネガティブ染色のためのカプセル法の利用 J. Vis. Exp. (2017).

このビデオでは、透過電子顕微鏡法のための安全なウイルス検体調製法を紹介します。ウイルス粒子をグルタルアルデヒドで固定し、電子密度が高い染色剤で染色した後、四酸化オスミウムによる蒸気固定を行うことで、構造を安定させるとともに完全な不活化を実現します。これにより、ウイルスサンプルの安全な取り扱いを確保しつつ、コントラストを向上させ、高品質なTEMイメージングを可能にします。

プロトコル

1. 水性グルタルアルデヒドおよび1%四酸化オスミウム蒸気不活化を用いたバイオコンテインメント内での陰性染色カプセル法

1. バイオコンテインメント用生物安全キャビネット（BSC）内で、ピペットに取り付けられたカプセルにウイルス懸濁液 40 µL を吸引します。
   注意：工程が完了するまで、ピペットはカプセルに取り付けたままにします。
2. グリッドを水平にした状態で、ピペットを横にして 10 min 置きます。これにより、コーティングされたグリッド上にウイルス粒子を均一に分布させます。
3. バイオコンテインメント BSC 内で、カプセル内のウイルスを不活化します。
   1. ピペットを持ち上げ、プランジャーを押し下げてウイルス溶液を廃棄容器に排出します。
   2. 2% グルタルアルデヒド固定液 40 µL をカプセルに吸引します。注意：グルタルアルデヒドは有害化学物質であり、適切な保護具が必要です。グルタルアルデヒドは短時間であれば通常の BSC で使用できますが、試薬を長時間開放した状態で使用する場合は、ダクト付き BSC または化学薬品用ドラフトチャンバーで作業する必要があります。
   3. ピペットを横にして 20 min 置きます。これにより、サンプルが十分に固定されるようにします。
   4. 固定液を排出し、脱イオン（DI）水 40 µL をカプセルに吸引して固定液を洗い流します。この洗浄ステップを計 3 回繰り返します。
4. 1% 酢酸ウラニル（UA）または 1% ホスホタングスト酸カリウム（PTA）のいずれかを 40 µL カプセルに吸引し、30 s 静置します。
   注意：染色時間はウイルスサンプルによって 10 s から 1 min まで変動する場合があります。
   警告：UA はアルファ線放出体であり、蓄積毒性があります。適切な保護具を用いて取り扱ってください。
5. ピペットからカプセルを取り外し、グリッドをカプセルに入れたまま、フィルターペーパーをグリッドの端に触れさせて吸い取り乾燥させます。
6. 四酸化オスミウム蒸気不活化手順。
   1. 蓋を開けた状態でカプセルを、1% 四酸化オスミウム溶液に浸したフィルターペーパーが入った 50 mL 遠心チューブに入れます。注意：四酸化オスミウムは極めて毒性が強く、蒸気圧が低いです。必ずダクト付き BSC または化学薬品用ドラフトチャンバーで使用してください。適切な保護具を用いて取り扱い、作業エリアに警告情報を掲示してください。
   2. 50 mL 遠心チューブを密閉して 1 h 置き、四酸化オスミウム蒸気を完全に浸透させます。その後、チューブを汚染除去し、バイオコンテインメント区域外の BSL-2 電子顕微鏡（EM）施設へ移送します。
7. カプセルから EM グリッドを取り出します。
   1. BSL-2 EM 施設にて、遠心チューブからカプセルを取り出し、ピペットに取り付けます。
   2. DI 水 40 µL をカプセルに吸引し、廃棄容器に 3 回排出します。
   3. ピペットからカプセルを取り外し、フィルターペーパーをグリッドの端に触れさせて吸い取り乾燥させます。
   4. 風乾後、後続の透過電子顕微鏡（TEM）観察に向けてグリッドを保存します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Formvar/カーボンコーティングTEMグリッド	SPI	3420C-MB	200 mesh Cu Pk/100
mPrep/g カプセル	EMS	85010-01	box
mPrep/f カップラー	EMS	85010-11	standard 16/Pk
グルタルアルデヒド	EMS	16320	50% solution, EM grade
四酸化オスミウム	EMS	19190	4% aqueous solution
酢酸ウラニル	EMS	22400	powder
ホスホタングステン酸カリウム	EMS	19500	powder
ろ紙	Whatman	1450-090	size 50
透過電子顕微鏡	JEOL	JEM-1011	TEM