方法論記事

ウイルス様ヌクレオカプシド粒子のin vitro再構成および精製

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2026年9月30日

この記事について

要約

Source: Gao, Y., et al. Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus. J. Vis. Exp. (2021)

The video demonstrates the in vitro assembly of virus-specific nucleocapsids from a purified RNA-free nucleoprotein–phosphoprotein complex, their purification by size exclusion chromatography, and validation of full-length viral RNA within the assembled particles.

プロトコル

1. 分子クローニング

注記：呼吸器合胞体ウイルス（RSV）の双シストロン性共発現構築プラスミドの作製には、リガーゼ独立クローニング（LIC）を用いました。LICは1990年代初頭に開発された手法で、T4 DNAポリメラーゼの3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を利用して、ベクターとDNAインサートの間に相補的なオーバーハングを形成させます。構築には、オープンリーディングフレーム（ORF）のN末端に10x Hisタグを持つ2BT-10ベクターDNAを使用しました（図1）。

  1. SSPI消化を用いてLICベクターの直線化を行う。
    1. 10 μLのSSPI 10Xバッファー、5 U/μL濃度のSSPI酵素4 μL、5 μgのベクターminiprep DNAに相当する容量、および滅菌ddH2Oを合わせて100 μLにする。
    2. 消化液を37 °Cで3時間インキュベートする。
    3. ベクターDNAを抽出するため、消化液を1.0%アガロースゲルで電気泳動する。
    4. ゲル抽出キットを用いて抽出および精製を行う。最終的なベクターDNAの容量を30 μLのddH2Oに懸濁し、-20 °Cで保存する。

  2. N1-391 Forward Primer、N1-391 Reverse Primer、P1-126 Forward Primer、およびP1-126 Reverse Primer（表1）を用いて、N1-391およびP1-126用のDNAインサートを調製する。

    注：直線化したベクターとの十分なオーバーラップがあり、融解温度が55 °Cから60 °Cの間になるように設計されている。リバースプライマーについても、同様の理由で直線化したベクターの相補鎖と十分なオーバーラップがある。

    表1. プライマー配列。

    プライマー配列
    N1-391 Forward5’-TACTTCCAATCCAATGCAATGGCCCTGAGCAAAGTGAAG-3’
    N1-391 Reverse5’-TTATCCACTTCCAATGTTATTACAGTTCCACGTCGTTGTCCTTGG-3'
    P1-126 Forward5’-TACTTCCAATCCAATGCAATGGAAAAGTTCGCCCCCGAG-3'
    P1-126 Reverse5’-TTATCCACTTCCAATGTTATTACTGGTCGTTGATTTCCTCGTAGC-3’
    1. 表2および表3の条件を用いて、DNAインサートのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅を行う。
    2. 増幅したDNAインサートを抽出する。前ステップのPCR産物を1.0%アガロースゲルで電気泳動し、ゲル抽出によりバンドを抽出・精製する。抽出したDNAの最終容量を15 μLのddH2Oに懸濁する。

    表2. DNAインサートのPCR増幅試薬。

    DNAインサートのPCR増幅 
    15 μL10x Pfu polymerase反応バッファー
    3 μLForwardプライマー（100 μM濃度）
    3 μLReverseプライマー（100 μM濃度）
    15 μL2.5 mM濃度のデオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP）ミックス
    6 μLNまたはPの遺伝子を含むプラスミドDNA（100ng/ μL）
    7 μLジメチルスルホキシド（DMSO）
    3 μLPfu polymerase（2.5U/μL）
    150 μLまで充填する量滅菌ddH2O

    表3. DNAインサートのPCR増幅サーモサイクリングプログラム。

    DNAインサートのPCR増幅
    ステップ時間温度サイクル数
    変性4 min.95 ºC1
    変性45 sec.95 ºC30
    アニーリング30 sec.62 ºC 
    伸長*90 sec.72 ºC 
    伸長10 min.72 ºC1
    ホールド∞4 ºC1
    150 μLの混合液を3つの独立したPCR反応（3 x 50μL）として実行可能。
    *Pfu DNA polymeraseの場合、伸長フェーズの推奨速度は1 kb/minである。ここでは、N1-391遺伝子およびP1-126遺伝子の長さが共に1.5 Kb未満であるため、伸長ステップに90秒を使用した。

  3. ベクターおよびインサートDNAのT4 DNA polymerase処理（表4）。

    表4. T4 DNA polymerase処理。

    T4 DNA polymerase処理 
    10 x バッファー2 μL
    ベクター/インサートDNA（0.1 pmolベクターまたは0.2 pmolインサート）5 μL
    25 mM dNTP*2 μL
    100 mM DTT1 μL
    T4 DNA polymerase（LIC適合）0.4 μL (1.25 U)
    滅菌ddH2O9.6 μL
    *ベクターにはdGTPを使用し、インサートDNAにはdCTPを使用した。

    注：処理はベクターDNAとインサートDNAで別々に行う必要がある。

    1. 混合液を室温で40分間インキュベートする。その後、75 °Cで20分間加熱し、ポリメラーゼを不活性化する。反応混合液を-20 °Cで保存する。
  4. LICベクターとインサートベクターをアニーリングさせる。
    1. 2 μLのLICベクターDNAと2 μLの滅菌ddH2Oを用いてネガティブコントロールを設定する。
    2. 前述のT4 DNA polymerase反応で得られた2 μLのインサートDNAと2 μLのLICベクターDNAを0.2 mLチューブに混合する。
    3. 室温で10分間アニーリング反応を行う。
    4. 25 mM濃度のエチレンジアミン四酢酸（EDTA）1.3 μLを加え、反応を停止させる。
    5. 反応液を100 μLのEscherichia coli Top10コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン選択プレートに塗布する。
  5. ポジティブなコンストラクトを同定する。
    1. プラスミドminiprep溶液を調製する。これはコロニーピッキングを行い、Luria Broth (LB)培地で接種することで行える。通常、3つのコロニーで十分である。
    2. 混合液を37 °Cで一晩インキュベートする。
    3. 混合液を4,560 x gで10分間遠心分離し、上清を捨てる。
    4. ペレットを250 μLのP1バッファーに再懸濁し、スピンminiprepキットを用いてプラスミドminiprepを行う。
    5. AseIまたはその他の制限酵素を用いて、miniprep産物の消化解析を行う。
    6. サンプルを0.8%アガロースゲルに負荷し、消化したプラスミドを泳動する。UVランプ下でゲルを解析する。
    7. シーケンシングサービスを利用して、ポジティブな産物の配列を検証する。

  6. 共発現DNAインサートを取得する。

    1. あらかじめ構築した2BT-10 N1-391および2BT-10 P1-126をテンプレートとして、PCRを行いN1-391およびP1-126を取得する。
    2. N1-391 ForwardプライマーとReverseプライマー 5 ́-GTGAAGATCCTGGCTGATGCAATGCGGCGGCGCGCCGCGATCGCGGATCC-3 ́を用い、表2および表3のPCR条件で、2BT-10 N1-391コンストラクトからN1-391を得るための第1次PCRを行う。
    3. Forwardプライマー 5’-CCGCCGCATTGCATCAGCCAGGATCTTCACTGCAGGACTCGAGTTCTAGA-3 ́とP1-126 Reverseプライマーを用い（表2および表3のPCR条件を使用）、2BT-10 P1-126コンストラクトからP1-126を得るための第2次PCRを行う。
    4. 最後に、前述の2つのPCR反応の混合産物に対してオーバーラップPCRを行い、N1-391とP1-126を融合させる。N1-391 ForwardプライマーとP1-126 Reverseプライマーを使用する。PCR条件は表5および表6に従う。

    表5. オーバーラップPCR試薬。

    オーバーラップPCR 
    15 μL10 X Pfu polymerase反応バッファー
    3 μLForwardプライマー（100 μM）
    3 μLReverseプライマー（100 μM）
    15 μLdNTPミックス（2.5 mM）
    3 μLN1-391遺伝子を含む第1回PCRのDNA（100 ng/μL）
    3 μLP1-126遺伝子を含む第1回PCRのDNA（100 ng/μL）
    7 μLDMSO
    3 μLPfu polymerase (2.5 U/μL)
    150 μLまで充填する量滅菌ddH2O

    表6. オーバーラップPCRサーモサイクリングプログラム。

    オーバーラップPCR
    ステップ時間温度サイクル数
    変性4 min.95 °C1
    変性45 sec.95 °C30
    アニーリング30 sec.62 °C 
    伸長*2 min.72 °C 
    伸長10 min.72 °C1
    ホールド∞4 °C1
    150 μLの混合液を3つの独立したPCR反応（3 x 50 μL）として実行可能。
    *Pfu DNA polymeraseの場合、伸長フェーズの推奨速度は1 kb/minである。ここでは、N1-391とP1-126の遺伝子の合計長が2.0 Kb未満であるため、伸長ステップに2分を使用した。
  7. ベクターとDNAインサートを結合させる。
    1. ステップ1.3のプロトコルに従い、オーバーラップPCR産物をT4 DNA polymeraseで処理する。
    2. ステップ1.4のプロトコルに従い、LICベクターとPCR産物をアニーリングさせる。
    3. ステップ1.5のプロトコルに従い、ポジティブなコンストラクトを同定する。

2. タンパク質の発現と精製

注：NおよびPを共発現させるバイシストロニック構成体にはE. coliを使用します。細胞は37 °Cで培養しますが、発現は低温（16 °C）で一晩行います。タンパク質複合体は、コバルトカラム、イオン交換、およびサイズ排除クロマトグラフィーを組み合わせて精製します（図2）。

  1. 使用する E. coli タンパク質生産用のBL21(DE3)株。4 Lの細胞培養物を以下の条件で増殖させる。 37 °C ODまでLB (Luria Broth) 培地で600 0.6に達する。
  2. 温度を～まで下げる 16 °C1時間後、0.5 mMのイソプロピル β-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）で一晩。
  3. 細胞を4,104 x gで25分間遠心分離し、上清を除去する。
  4. 細胞ペレットを200 mLの溶解バッファーA（50 mM リン酸ナトリウム, pH 7.4, 500 mM NaCl, 5 mM イミダゾール, 10% グリセロール, 0.2% NP40）に再懸濁する。1 Lの細胞培養液から得られた細胞ペレットの再懸濁には、50 mLの溶解バッファーを使用すること。

  5. 超音波処理（15分間、3秒間照射し3秒間休止）により細胞を溶解させる。その後、37,888 x gで40分間、細胞を遠心分離する。

    注： このプロトコルは、超音波処理の前に細胞を-80℃で凍結させることで一時中断することが可能です。80 °C フリーザー

  6. 5～10カラムボリューム（CV）の溶解バッファーで平衡化した約10mLのビーズを含むコバルト重力カラム（直径x長さ：2.5 cm x 10 cm）に、上清をロードする。
  7. カラムを5 CVのバッファーB（50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 M NaCl, 10% glycerol, 5 mM imidazole）および5 CVのバッファーC（50 mM Tris-HCl pH 7.4, 500 mM NaCl, 10% glycerol, 5 mM imidazole）で洗浄する。
  8. 2 CVのバッファーD（50 mM Tris-HCl pH 7.4、500 mM NaCl、250 mM イミダゾール）を用いて、ビーズからタンパク質を溶出させる。
  9. Qカラム用に、溶出タンパク質をQAバッファー（50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5% Glycerol）で5倍に希釈する。
  10. 5 mLのQカラムをQAバッファーで洗浄して平衡化し、次いでペリスタルティックポンプ（Rabbitなど）を用いて希釈したサンプルをQカラムにロードする。
  11. Qカラムを、QAバッファーおよびQBバッファー（50 mM Tris-HCl pH7.4, 1.5 M NaCl, 5% glycerol）とともにHPLC装置にセットする。流速を1 mL/minに設定する。
  12. 「ポンプ洗浄」プログラムを実行し、QBバッファー、続いてQAバッファーで装置を洗浄します（各1～2 CV）。システム流量を3 mL/minに設定してください。
  13. UV1を280 nmに、UV2を260 nmに設定してください。分画の回収には96深孔プレートを使用します。
  14. 溶出剤（QB緩衝液）の段階的グラジエントを用いてタンパク質を溶出させる。0% QBから開始し、濃度を5%ずつ上昇させ、各濃度で3～4 CV（カラムボリューム）ずつ適用する。NPタンパク質複合体は、15% QB緩衝液で溶出される。
  15. すべてのタンパク質が溶出された後、100% QBバッファー（2 CV）でカラムを洗浄してください。
  16. ゲルろ過用Superdex 200 Increase 10/300 GLカラム（直径×長さ：1.0 cm x 30 cm）を用いてタンパク質を単離し、バッファーE（20 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸、またはHEPES pH 7.4および200 mM NaCl）で平衡化する。
  17. タンパク質含有画分を、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により分析する。

3. ウイルス特異的NCのin vitroアセンブリ

注記： RS V特異的NC（N:RNA）のin vitroアセンブリは、調製したN0P複合体をRNAオリゴヌクレオチドとともにインキュベートすることで行いました。その後、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を用いて、アセンブリ複合体をN0Pおよび過剰なRNAから分離しました（図2）。

  1. 精製したN0P複合体とRNAオリゴをモル比1:1.5で混合し、室温で1時間インキュベートする。通常、濃度1 mg/mLのN0Pタンパク質1 mLあれば次ステップに十分である。同量のN0Pタンパク質のみを含むコントロールサンプルを用意する。
  2. ゲルろ過用Superdex 200 Increase 10/300 GLカラムをバッファーE（20 mM HEPES, pH 7.4, 200 mM NaCl）であらかじめ平衡化させる。
  3. サンプルを21,130 x gで15分間遠心分離し、沈殿物を除いて上清をSECカラムにロードする。
  4. N:RNAアセンブリサンプルとN0PコントロールサンプルのSECクロマトグラフィー画像を比較し、A260/A280比と合わせて、どのピークがアセンブリされたN-RNA、N0P、および遊離RNAであるかを特定する。
  5. ピーク画分を回収し、SDS-PAGE जेलを実行するか、グリッドを作成する。
  6. アセンブリされたN-RNA複合体について、N-RNAピークの全画分を回収し、RNA抽出を行い、Urea-PAGEゲルを実行して、第1ステップで混合・インキュベートしたものと同じ特異的RNAの長さを再確認する。

結果

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図1. プラスミド構築の模式図。 A. RSV N1-391の構築物。 B. RSV P1-126の構築物。 C. N1-391とP1-126を共発現させるためのバイシストロニック構築物。 1番目の遺伝子であるRSV N1-391、2番目の遺伝子であるRSV P1-126、抗生物質耐性遺伝子（AmpR）、およびプロモーターを、それぞれ黄色、シアン、ピンク、オレンジのボックスで強調表示している。 要約すると、RSV N1-391およびRSV P1-126の遺伝子インサートを個別に構築し、それらをアセンブルした。

figure-results-2

図2. タンパク質複合体N1-391P1-126の精製のフローチャート。ここでは、E. coli細胞培養の接種と大規模培養、および遠心分離による細胞回収の手順が示されています。細胞溶解後、タンパク質サンプルはアフィニティークロマトグラフィー（Co2+カラム）、イオン交換クロマトグラフィー（Qカラム）、およびゲルろ過サイズ排除（SEC）クロマトグラフィーによって精製されます。さらに、タンパク質サンプルはSDS-PAGEゲルによって分析されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アガロースSIgmaA9539-500GLIC法を用いたコンストラクト作製
アンピシリンナトリウムGOLD BIOTECHNOLOGY5118.111317A細胞培養用抗生物質
AseINEBR0526SLIC法を用いたコンストラクト作製
コバルト（高密度）アガロースビーズGold BioH-310-500Hisタグタンパク質の精製用
Corning LSE デジタルドライバスヒーターCORNING6885-DBサンプルの加熱
dCTPInvitrogen10217016LIC法を用いたコンストラクト作製
dGTPInvitrogen10218014LIC法を用いたコンストラクト作製
グリセロールSigmaG5516-4L溶液の調製
HEPESSigmaH3375-100G溶液の調製
HiTrap Q HPSigmaGE29-0513-25タンパク質精製
イミダゾールSigmaI5513-100G溶液の調製
IPTG（イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド）GOLD BIOTECHNOLOGY1116.071717Aタンパク質発現の誘導
マイクロ遠心チューブVWR47730-598PCR用
Misonix Sonicator XL2020 超音波液体プロセッサーSpectraLabMSX-XL-2020細胞溶解用ソニケーター
New Brunswick Innova 44/44ReppendorfM1282-0000細胞培養用シェーカー
Nonidet P 40 代替品Sigma74385-1L溶液の調製
OneTaq DNAポリメラーゼNEBM0480LPCR
QIAquick Gel Extraction KitQIAGEN28706DNA精製
SSPI-HFNEBR3132SLIC法を用いたコンストラクト作製
Superose 6 Increase 10/300 GLSigmaGE29-0915-96タンパク質精製
T4 DNAポリメラーゼSigma70099-3LIC法を用いたコンストラクト作製
Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus 遠心機Fisher Scientific36-101-0816遠心機、最高回転数 20,000 rpm
トリズマ塩酸塩SigmaT3253-250G溶液の調製

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ウイルスヌクレオカプシドの構築サイズ排除クロマトグラフィーRNAフリーヌクレオプロテインホスホプロテイン複合体ウイルスRNAの取り込みゲルろ過尿素PAGEN-RNA複合体
ウイルス様ヌクレオカプシド粒子のin vitro再構成および精製
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