免疫細胞化学によるジカウイルスdsRNA複製中間体の検出

要約

ジカウイルスゲノム複製アッセイ 12ウェルプレートを用い、1ウェルあたり1 x 10⁵個の未感染Vero細胞を2 mlの容量で播種する。翌日、無血清培地を用いて、低タイターおよび高タイターのウイルス接種液（感染多重度（MOI）を0.01および0.1とし、1ウェルあたり400 µl）を3連で調製する。模擬感染（モック感染）には、無血清培地のみ（1ウェルあたり400 µl）を使用する。接種したプレートを37 °C、5% CO₂条件下で4〜6時間インキュベートする。1時間ごとにプレートをゆっくりと左右に傾け、接種液を広げる。インキュベーション終了後、接種液を血清添加培地（1ウェルあたり2 ml）に交換する。48時間および96時間の時点で、免疫細胞化学（ICC）用のサンプルを回収する。メタノール固定した細胞を用いてICCを行う。固定した細胞を1xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回洗浄し、ICCブロッキングバッファー（PBS含有3%ヤギ血清、3%ウシ血清アルブミン（BSA）、0.1% Triton-x 100）でブロッキングする。マウスモノクローナル抗dsRNA抗体J2（1 µg/ml）をブロッキングバッファーで1:100に希釈して使用し、4 °Cで一晩インキュベートする。細胞を1x PBSで洗浄し、二次抗体であるヤギ抗マウスIgG-594（1 µg/ml）をブロッキングバッファーで1:1,000に希釈して加え、室温で1時間インキュベートする。細胞を1x PBSで洗浄し、Hoechst染料を用いて核を染色し、蛍光顕微鏡を用いて100倍の倍率で細胞を観察する（図1）。 Contreras, D., 他ジカウイルス感染細胞培養系およびインターフェロンのin vitro予防効果 J. Vis. Exp. (2016)

このビデオでは、免疫細胞化学を用いて、感染した上皮細胞におけるジカウイルスのdsRNA中間体の検出について説明します。感染細胞を固定し、ブロッキング液でブロッキングします。その後、一次抗体および二次抗体を添加します。核を蛍光染料で染色し、ラベル化されたウイルスのdsRNAを蛍光顕微鏡下で観察します。

プロトコル

1. ジカウイルスゲノム複製アッセイ

1. 12ウェルプレートを用い、naïve Vero細胞を1ウェルあたり1 x 10⁵ cellsの密度で2 mlの容量で播種する。翌日、無血清培地を用いて、低タイターおよび高タイターのウイルス接種液（感染多重度 (MOI) 0.01および0.1、400 µl/well）を3反復で調製する。擬似感染（mock infection）には、無血清培地（400 µl/well）のみを使用する。
2. 接種したプレートを37 °C、5% CO₂条件下で4-6時間インキュベートする。1時間ごとにプレートを優しく左右に傾け、接種液を広げる。
3. インキュベーション終了後、接種液を血清添加培地（1ウェルあたり2 ml）に交換する。
4. 48時間および96時間のタイムポイントで、免疫細胞化学（ICC）用のサンプルを回収する。
5. メタノール固定した細胞を用いてICCを行う。
   1. 固定した細胞を1x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で3回洗浄し、ICCブロッキングバッファー（3% goat serum、3% Bovine serum albumin (BSA)、0.1% Triton-x 100 in PBS）でブロッキングする。
   2. マウスモノクローナルanti-dsRNA抗体 J2 (1 µg/ml) をブロッキングバッファーで1:100に希釈して使用し、4 °Cで一晩インキュベートする。
   3. 細胞を1x PBSで洗浄し、二次抗体であるgoat anti-mouse IgG-594 (1 µg/ml) をブロッキングバッファーで1:1,000に希釈して加え、室温で1時間インキュベートする。
   4. 細胞を1x PBSで洗浄し、Hoechst染料を用いて核を染色し、蛍光顕微鏡の100倍倍率で細胞を観察する（Figure 1）。

結果

図1： ジカウイルス（ZIKV）複製評価アッセイ。(A) 逆転写定量PCR（RT-qPCR）により測定したジカウイルスのゲノム量を示すグラフ。パンゲノタイプ（ZIKV GEN）およびPRVABC59株（ZIKV UNI）の両プライマーで、同等の感度と特異性が示された。予想通り、C型肝炎ウイルス（HCV）プライマーでは産物は増幅されなかった。(B) 低タイターおよび高タイターで感染させた細胞における、指定の時間経過に伴うジカウイルスの増殖キネティクスを、非感染のモックコントロールと比較して示したグラフ。平均値と標準偏差を記載している。(C) ウイルス複製を調べるための免疫細胞化学アッセイ。ジカウイルス感染細胞をdsRNA抗体で特異的に染色した。感染48時間後（hpi）では感染細胞は少数のクラスターとして存在するが、96 hpiではほとんどの細胞が感染している。核の可視化にはHoechst染色を用いた（スケールバー = 50 µm）。BF：明視野像。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Sigma Life Science	D5796
HEPES	Life Technologies	15630080
Glutamax	Life Technologies	35050061
マウスモノクローナル抗dsRNA抗体 J2	English & Scientific Consulting Kft.	10010200
ヤギ抗ウサギIgG Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020
Vero細胞株	ATCC	CCL-81
ジカウイルス株 PRVABC59	Centers for Disease Control and Prevention (CDC)
Nikon Intenselight C-HGFI搭載 Nikon Eclipse Ti 免疫蛍光顕微鏡	Nikon	Visit Nikon for Request