ウイルスの濃縮および精製 40%ポリエチレングリコール6000および1.5 M NaClをddH2Oに添加し、5倍濃縮ポリエチレングリコール6000溶液を調製する。この溶液を液体サイクルで121 °C、45分間オートクレーブする。冷却時に溶液をゆっくりと混ぜ合わせる。 注：溶液は最初は濁っているが、冷却されるにつれて透明になる。 不溶性物質をペレット化するため、2回分のウイルス上清を含む50 mlコニカルチューブを2,000 x gで10分間遠心分離する。0.45 µmの低タンパク結合シリンジフィルター（PESまたはPVDF）でろ過し、ウイルス培地を精製する。 培地に5倍濃縮ポリエチレングリコール6000溶液を添加する（最終濃度はポリエチレングリコール6000が8%、NaClが0.3 Mとなるようにする）。チューブを数回反転させて混ぜ合わせる（ボルテックスミキサーは使用しない）。ウイルスを含むポリエチレングリコール溶液を4 °Cで12時間以上インキュベートし、時々混ぜ合わせる。 （9日目）ウイルスを含むポリエチレングリコール溶液を2,500 x gで45分間遠心分離する。上清を除去して廃棄し、さらに2分間遠心分離する。再度、上清を除去して廃棄する。 320 µlの滅菌リン酸緩衝生理食塩水（この320 µlは、回収したウイルス含有培地の元の容量の1/100に相当する）を加えてペレットを再懸濁し、4 °Cで一晩インキュベートする。オプションとして、ロッカの上で室温にて30分間ペレットを再懸濁させることも可能である。 ペレットを再懸濁した後、ウイルスを分注し（0.5 mlチューブあたり5〜10 µl）、分注したものを-80 °Cで冷凍保存する（凍結融解や4 °Cでの保存は、タイターを著しく低下させる）。 標準的なプロトコルを用いてウイルスのタイターを測定する。具体的には、HEK293T細胞を播種した6ウェルプレートで希釈系列を行い、48時間後に蛍光コロニーを手動で計数する。 Fricano-Kugler, C. J., 他 定位脳手術による注射を用いた高タイターCRISPRレトロウイルスおよびレンチウイルスの設計、パッケージング、および導入。 J. Vis. Exp. (2016).
このビデオでは、宿主細胞の残骸を含む混合懸濁液からレンチウイルス粒子を濃縮および精製するステップバイステップのプロセスを実演します。この手順では、遠心分離、ろ過、およびPEG-塩沈殿法を用いて、可溶性不純物を除去しながらウイルス粒子を単離します。最終産物は緩衝液で再懸濁され、ウイルスの感染能と構造的完全性を維持するために超低温で保存されます。
