1. 細胞および試薬の調製
- アッセイの前日に、対象となるウイルスの適切な宿主細胞をプレートに播種します（表1 および 表2）を90～100%のコンフルエンスで。
- 10%ホルムアルデヒドを含む固定液をH2Oで調製する。2O. 例として、36%ホルムアルデヒド原液5.56 mlと蒸留水14.44 mlを混合し、2O (dH2O)2O).
注： ホルムアルデヒドを使用する際は、適切な安全取り扱い手順を遵守し、換気を行ってください。 - クリスタルバイオレット染色液の調製：20%エタノールおよび蒸留水（dH2O）を用いて、1%クリスタルバイオレット（CV）溶液を作成する。2O.
- 2倍濃度のプラーク培地（細胞種に応じて2倍濃度で調製。参照： 表2）。以下のものを用いてろ過します。 0.2 µm 試薬に滅菌されていないものがある場合は、ろ過してください。
- 固定用オーバーレイの調製（表3)
- 液体オーバーレイ用として、Avicelの2.4%滅菌水溶液（dH2O）を調製する。2O. 凝集を防ぐため、撹拌子で急速に撹拌している水が入ったフラスコに粉末を加え、Avicelをゆっくりと注ぎながら室温（RT）で激しく撹拌する。溶液の粘度が高くなり、撹拌子では均質化できなくなった場合は、フラスコシェーカーに切り替えて >均一に均質化させるため、激しく撹拌しながら30分間置く。
注： ストックソリューションはより低濃度で調製することも可能ですが、溶液が分離することがあるため、均質性を確保するために再混合する必要があります。Avicelのワーキングソリューションは、0.6～3%の範囲で使用できます。 - ホモジナイズ後、溶液をオートクレーブし、密閉した状態で室温で保存する。
- アガロースおよびカルボキシメチルセルロース（CMC）オーバーレイ用として、蒸留水（dH2O）を用いてストック溶液を調製します。22% CMCまたは0.6%アガロースを加える。スターバーを用いて混合し、オートクレーブまたは電子レンジで加熱して溶解させる。
2. 希釈および感染
- 播種日の翌日、アッセイを開始する前に、細胞のコンフルエンシーと生存率を視覚的に確認します。標準的な細胞形態であり、約90%コンフルエントな単層が存在することを確認してください。
- 感染サンプルの10倍連続希釈を行います。希釈液には、ウイルス増殖用の細胞増殖培地を使用します（表 2）。対象ウイルスの予想力価に基づいて必要な希釈回数を調整し、細胞の生存率を独立して確認しプラークの同定を容易にするため、常に非感染コントロールサンプルを使用してください。
- 連続希釈液を用いて、細胞を45分から1時間感染させます（表 1）。細胞を覆うのに十分な量の接種液を使用しますが、ウイルスと単層の接触を最大化するために、液量は可能な限り低く抑えます（表 4）。均一に広げ、細胞単層の乾燥を防ぐため、20分ごとにプレートを緩やかに揺らしてください。
- 感染後、2xプラーク培地と選択した固定用オーバーレイ（CMC、アガロース、またはAvicel）を1:1で混合したものを、ウェル内の接種液に直接、適切な量だけオーバーレイします（表 2）。緩やかに揺らして混合します。
- 液体オーバーレイの場合、加温した2xプラーク培地と1.2-2.4% RTストックAvicelを1:1で混合し、0.6-1.2% Avicelオーバーレイ培地の作業溶液を作成します。
- アガロースオーバーレイの場合、加温した2xプラーク培地と加熱した0.6%アガロースストック溶液を1:1で混合し、56 °Cのウォーターバスで30分間静置して温度を等しくし、最終的なアガロース/オーバーレイ濃度を0.3%にします。
- CMCの場合、2%ストック溶液を調製し、アガロースオーバーレイと同様の手順で処理します。
- 単層にオーバーレイを適用する際は、単層へのダメージを防ぐため、常に加熱したアガロースまたはCMCを56 °Cの水で温度調整してください。細胞死やウイルス力価の低下を防ぐため、溶液が温かく、かつ触っても熱くないことを確認してください。ほとんどのアガロースオーバーレイは42 °C以下で凝固し始めるため、取り扱い中の凝固を防ぐために迅速に作業するか、少量を都度調製してください。
- オーバーレイの添加後、明確に計数可能な個別のプラークが形成されるまでプレートをインキュベートします。プラーク形成には、解析するウイルスによって2～14日かかります（表 1）。
注意：液体オーバーレイを施したプレートをインキュベーターに入れた後は、移動させないでください。インキュベーション期間中に液体オーバーレイが移動すると、プラークが塗りつぶされたようになります。アガロースおよびCMCオーバーレイは半固体であるため、移動させたり、プラークの発達を監視するために定期的に光学顕微鏡で確認したりすることが可能です。
3. 細胞の固定および染色
- 細胞を固定するため、Avicelオーバーレイを捨て去るか吸引し、10%ホルムアルデヒド溶液を用いて30分から一晩かけて細胞を固定する（6ウェルプレートの場合、1ウェルあたり<1 ml）。
- アガロースまたはCMCの場合は、ホルムアルデヒド溶液をオーバーレイに直接加え、1時間から一晩置く。
注： 固定液が蒸発して乾燥すると単層が歪む可能性があるため、蒸発させない限り、サンプルを固定液中で長期間保存することができる。
- 染色前かつ固定後に、ホルムアルデヒドを廃棄し、アガロースおよびCMCの半凝固プラグを流水またはスパチュラを用いて手動で除去する。Avicelプラークは、染色の前に水でリンスして、残留しているオーバーレイや固定液を除去する。
- 染色の際は、最小量のクリスタルバイオレット溶液で細胞を約15分間覆う。均一に覆われるよう、必要に応じてプレートを揺らす。
- クリスタルバイオレット染料を水で穏やかに洗い流す。固定、染色、乾燥が完了した後、プラークを今後の解析のために無期限に保存する。
表1. プラークアッセイの接種条件および細胞種
| | RVFV | VEEV | インフルエンザB型 |
| 細胞型 | Vero | Vero | MDCK |
| 感染期間 | 1 hr | 1 hr | 45 min |
| 培養時間 | 3 days | 2 days | 3 days |
表 2. プラークおよびウイルス/細胞増殖培地
| | RVFV | VEEV | Influenza B |
| 細胞種 | Vero | Vero | MDCK |
| 増殖培地 | DMEM1 | DMEM1 | DMEM2 |
| プラーク形成培地 | 2xEMEMA | 2xEMEMA | 2xEMEMB |
1. 10% ウシ胎児血清、1% L-グルタミン、1% ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDulbecco's Modified Eagle Medium。
2. 1% L-グルタミン、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、0.2% 牛血清アルブミン、0.025% HEPES、DEAE-デキストラン 50ug/mlを添加したDulbecco's Modified Eagle Medium。
A. 2倍濃縮最小必須培地 (500 ml) に、5% FBS (25 ml)、1% 最小必須アミノ酸 (5 ml)、1% ピルビン酸ナトリウム (5 ml)、1% L-グルタミン (5 ml)、2% ペニシリン/ストレプトマイシン (10 ml) を添加したもの。
B. 0.2% 牛血清アルブミン、1% 必須アミノ酸（5 ml）、50ug/ml、0.025% HEPES、DEAE-デキストラン、Trypsin-TPCK* を添加した 2x 最小必須培地 (500 ml)
*調製の直前に、プラーク形成用にアガロースと混合して使用する分注量に対し、2 µg/ml TPCK-Trypsinストック溶液を25 mlあたり1 µl添加してください。
表3. オーバーレイストック
| | RVFV | VEEV | B型インフルエンザウイルス |
| 細胞種 | Vero | Vero | MDCK |
| 感染期間 | 1時間 | 1時間 | 45分 |
| 培養時間 | 3日間 | 2日間 | 3日間 |
表4. プレート形式
| | 6ウェル | 12ウェル | 96ウェル |
| 細胞数/ウェル | 5 x 105 | 2.5 x 105 | 3 x 104 |
| 接種量 (μl) | 400 | 200 | 50 |
| オーバーレイ量 (ml) | 3 | 1.5 | 0.100 |
