Method Article

酵母のコロニーの埋め込み法

DOI:

10.3791/2510

⸱

March 22nd, 2011

 , 
1School of Biological Sciences, University of Missouri - Kansas City

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

光および電子顕微鏡用切片可能に酵母のコロニーを埋め込むための方法。このプロトコルは、真菌、コミュニティ内での細胞型の組織を理解するための新しいツールを提供してコロ​​ニー内に胞子形成細胞と偽菌糸細胞の分布を決定することができます。

Abstract

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胚の異なる細胞型のパターニングは、後生動物の発生において重要なメカニズムです。このようなコロニーやバイオフィルムのような微生物のコミュニティは、また、細胞の種類のパターンが表示されます。例えば、酵母のS.出芽酵母は 、胞子形成細胞と偽菌糸細胞が一様にコロニーで配布されていません。パターニングとこれらのパターンの根底にある分子機構の機能的重要性はまだよく理解されています。

真菌コロニーの細胞型のパターンを調査に関して、1つの課題は、後生動物の組織とは異なり、コロニー内の細胞は比較的弱く、お互いに接続されていることです。特に、真菌のコロニーはほとんどの組織に見られる細胞外マトリックスの同じ豊富なレベルが含まれていません。ここでは、これらのコロニーの細胞型の内部のパターンを明らかに酵母のコロニーを埋め込むとセクショニングの方法で報告する。方法は、光学顕微鏡および透過型電子顕微鏡に適した薄切片（0.1μ）のために有用（0.5μ）厚い切片を作製するために使用することができます。これらの細胞の内部構造はEMによって可視化することができますがASCIと偽菌糸の細胞が容易に、光学顕微鏡で卵形の酵母の細胞と区別することができます。

メソッドは、寒天でコロニーを囲むスパーの培地でそれらを浸潤し、切片に基づいています。 1〜2ミリメートルの範囲の直径を持つコロニーは、このプロトコルに適しています。コロニーの内部を可視化することに加えて、メソッドは基になる寒天に侵入するコロニーの領域を可視化できる。

Protocol

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1。コロニーの単離と固定

  1. 指定された時間のために寒天培地に300コロニーをインキュベートする（孤立コロニーは直径に1-2 mmにしてください）​​。
  2. コロニー（顔のアップ）と狭いヘラを使用して、基礎となる培地を削除します。
  3. 2％寒天、42℃、それが固化する前に、寒天の表面に1 mLのpipetmanの先端と、すぐに場所のコロニーを用いて顕微鏡スライド上にCを数滴を置きます。
  4. 42 ° Cコロニーに2％の寒天を数滴を配置し、固化することができます。
  5. このプロトコルの残りの部分を通じてすべてのステップのための手袋を着用してください
  6. かみそりの刃を持つブロックをトリムし、4℃で7日間、2％パラホルムアルデヒド/ 2％グルタルアルデヒド固定液を含む3.5mLのホウケイ酸塩のスクリューキャップ付きバイアルの中に置いてください

2。洗浄およびオスミウム処理

  1. 約1週間後、完全に同じボリュームで5分間、その後、植民地（約1.5mL）をさらに2回をカバーするのに十分な0.15Mカコジル酸ナトリウム（pH7.2）で15分間二回インキュベートすることにより、化学煙フードの下に氷の上の寒天ブロックを洗う1X OSバッファー（100mMのKH 2 PO 4 10mMのMgCl 2、pH6.0）での....

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Discussion

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提示方法は、コロニーの内部構造を明らかにする。方法は、Sの範囲内のセルのタイプのパターンを決定する上で効果的ですので、別のコロニーの形態を持つ、とも近縁種S. paradoxus 5の出芽酵母株は 、この方法はまた、真菌や他の微生物の広い範囲で動作する可能性があります。

メソッドの成功のための一つの重要なステップは、コロニーの上部を含む全体のコロニーが、、プロトコル全体に寒天で包まれていることを確認することです。コロニーは寒天で完全に覆われているかどうかは、トルイジンブルーと光学顕微鏡と染色のために切削後に決定することができます。染色した切片を光学顕微鏡で見た場合、寒天培地は、包埋媒体よりも若干暗く染色される。脱水工程中の寒天の縮小、コロニー全体を回復するためには、必要があります。なぜなら：1）ステップ1.2のコロニーを確実にカバーするために寒天の4-5滴を追加し、2）ではないで、唯一の両側に寒天をトリム上部と下部、そして必要なだけのそれは、ステップ1.5の金型内に収まるようにトリミング。

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Disclosures

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利害の衝突は宣言されません。

Acknowledgements

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研究は、NIH 1R15GM094770によって資金を供給された。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
四酸化オスミウム電子顕微鏡科学RT 19152
シリコーン埋め込み金型フィッシャーサイエンティフィックNC 9975029
脂環エポキシ樹脂電子顕微鏡科学RT 15004ERL 4221
エポキシ樹脂電子顕微鏡科学RT 13000DER 736
無水コハク酸ノネニル電子顕微鏡科学19050NSA
2-ジメチルアミン–thanolElectron Microscopy SciencesRT 13300DMAE
実装媒体KPL Inc71-00-16
回転ホイールTed Pella, Inc.Pelco 1055
ミクロトームライカ マイクロシステムズUltracut S
RT

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kimmel, A. R., Firtel, R. A. Breaking symmetries: regulation of Dictyostelium development through chemoattractant and morphogen signal-response. Curr Opin Genet Dev. 14, 540-540 (2004).
  2. Palkova, Z., Vachova, L. Life within a c....

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