マイクロパターン細胞を用いた薬物の効果の改善可視化と定量分析

Summary

細胞構造を正常化する接着剤微細パターンは、薬剤の効果の検出感度を向上させる再現性を改善し、自動画像収集と分析を簡素化するために使用できます。そのような技術は、従来の細胞培養担体上で実行し、結果的に過剰な細胞間のばらつきを患っている薬剤/ siRNAのスクリーニングアッセイを、利益になる。

Abstract

これまでに、ほとんどのHCA（ハイコンテント分析）の研究は、マイクロプレートを扱う組織培養における同種基板上に成長した接着細胞株を用いて実施されています。これらの条件下で、細胞が広がると、細胞の形状、形態や行動に内在するばらつきに起因するすべての方向に分ける。全体の人口の高い細胞間の差異は、特に医薬品開発のために、HCAの成功を妨げている。すべての個々の細胞の形状と内部の極性を正規化する微細パターンの能力は、この重大なボトルネック^1-2を解決するための大きな機会を提供します。

微細技術のアクセスと使用を容易にするために、CYTOOはカバースリップとマイクロウェルフォーマットで利用可能な、微細パターンを使用する準備の範囲を開発しました。このビデオの記事では、我々はCYTOOchipの微細パターン、薬物治療、自動取得に固定し、染色、自動画像処理や最終的なデータ分析上の細胞播種からすべての手順の詳細なプロトコルを提供しています。この例では、我々は微細パターンは、セルベースアッセイを容易にすることができる方法を示しています。細胞の細胞骨格の変化はすべての細胞の細胞接着の接触の体系的位置づけのため、アクチンの網目構造の再現可能な組織内の微細パターンの結果についての同種の基板上に培養細胞が、培養細胞で定量化が困難です。 blebbistatin、アクチン - ミオシンの相互作用の阻害剤を使用するプロトコルのこれらのセットで示すように細胞内のアーキテクチャのような正規化は、アクチン細胞骨格上にも小さな効果の定量化が可能になります。

Protocol

1。微細パターン上に細胞の調製とその種

1. あなたがCYTOOchipの右下隅にある"CYTOO"を一読することを確実に6ウェルプレートの2つの独立したウェルにおけるプレイス2 CYTOOchipsを。微細パターンは、蛍光Cy3またはCy5色素で標識することができます。この実験に用いたCYTOOChipsはCy3蛍光微細パターンラベルを貼っている。
   注意：暗闇の中でチップを保管してください。
2. トリプシン処理によってHeLa細胞を（〜80％コンフルエント）を収集。細胞が適切にトリプシン処理により分散されていることを顕微​​鏡下で確認してください。 4分間300グラムで細胞を回収し、遠心分離、そして穏やかに細胞ペレットを再懸濁します。細胞をカウントし、完成したDMEM/F12培地で15,000細胞/ mLの濃度に希釈する。
3. CYTOOchipを含む各ウェルに4 mLの（60,000細胞）を分注する。
   注意：プレートはこれが中心に細胞を集中する傾向があるとして、培地内の任意の回転の動きを誘導避けるために、できるだけ少ないとして移動する必要があります。
4. ボンネットの下で10分間細胞の堆積物は、セルインキュベーターに移動​​してみましょう。 10-20分後、細胞は微細パターンに従うことを開始します。 10分後、顕微鏡下で定期的に確認してください。
5. とすぐにセルが取り付けられているように、細胞の培地を変更して、ゆっくりと次の手順を使用して、カバーの表面をフラッシュします。
6. プレートがフラットに保つ、静かにもの側面からピペットで培地を吸引除去する。
   注意：チップドライアウトを聞かせてはいけない、これはすべての液体をオフに吸引ありませんが、すべての回でCYTOOchipをカバーするのに十分なままにしないことを意味します。
7. 4 mLのPBSを加え、よくの側に移動し、チップの中央で始まる最初再び吸引する。空気にチップを公開することなく説明するようにPBSをオフに吸引除去する。 3-4回を繰り返します。
8. 浮遊細胞を顕微鏡で確認します。
   • 浮遊細胞の多数が残っている場合は、洗浄操作を繰り返します。
   • あなたは非常にいくつかのセルを参照する場合は、PBSの一部を吸引し、2mLの新鮮な培地に交換してください。吸引除去し、二度新鮮な培地を4mLを追加します。
9. ℃で3時間の最低5％CO ₂で細胞が広がってフルを達成できるように、37℃で組織培養インキュベーターでプレートを置きます。
   注記：10-30％の間でこの方法を使用するには（2000〜6500）微細パターンは、単一または複数のセルによって占有されます。
   注意：洗浄工程の前に付着する細胞に必要な時間と完全な微細パターン上のセルの拡散に必要な時間は、各細胞株に固有になります。

2。 Blebbistatinトリートメント

1. 17mmのストック溶液を得るために100％DMSOにblebbistatinを溶かす。 100％DMSOで5mMのにさらにストック溶液を希釈する。 0.1％DMSOで5μMのblebbistatinの最終濃度を得るために培養液中で最終希釈を行う。
2. 制御条件については、わずか0.1％のDMSOを含む培地を4mLを準備。
3. 細胞の培地を吸引除去し、処理および制御条件のために調製した4 mlの培地に交換してください。
4. 37℃で1時間、細胞をインキュベート℃を

3。アクチンの細胞の固定と染色

1. 細胞固定用溶液の調製
   細胞骨格バッファ（CB）とPFA 5％の調製のための試薬の項を参照してください。 CBは、特にアクチンフィラメントと微小管の蛍光標識することをお勧めします。
   • 1xCB -スクロースを準備します。CBの2 mLにショ糖1gを追加。
     ショ糖を含めることは、内部セル構造を維持することができます。
   • 4％PFA - CB -スクロースを準備します。暖かいPFA 5％の4mLに1xCB - スクロース1 mLを追加する。
     注意：このソリューションは、4℃で数日しか保つことができる。
2. PFA固定
   • 4％PFA - CB -スクロース溶液2mLを含む6ウェルプレートのウェル中のCYTOOのロゴと場所、それを（洗浄なし）でCYTOOchipを拾うために鉗子を使用して、
   • 室温で10分間インキュベートします
   • PFA - CB -スクロースを削除し、PBSで1回洗浄
   • 残留PFAの架橋活性をクエンチするために10分間を100mM NH _{4 Cl}の2 mLの2番目の洗浄を行う
     注：PFA固定スライドは4℃で数日間PBS中で保存することができる·蛍光イメージング用オルガネラ染色の前にC。
3. トリトンX - 100による細胞膜の透過化
   洗剤で細胞の透過化は、抗体または他のプローブは、細胞膜を透過することができますし、それ以外の場合は難しい、その局在を解析すること細胞骨格ポリマーのコントラストを減らすことができる細胞骨格蛋白質の細胞質プールの一部を排除。
   • 室温で3分間NH ₄ Clを削除し、2 mlを加え/ウェルの0.1％のTriton X - 100 - CB
   • 2 mLのPBSで2回洗浄
4. アクチンの染色
   ネイティブアクチンに結合するだけアクチンfilamenを染色するために使用される蛍光ファロイジンTS。
   • 1.5％BSAを含むPBSで1:2000に希釈したFITC結合ファロイジン2 mlを加え
   • 室温でインキュベート1時間
   • 2 mLのPBSで1回洗浄
5. 核の染色
   • ヘキスト2 mlを加え（PBSで1μgの/ mLで染色）
   • 室温で3分間インキュベートする
   • 2 mLのPBSで2回洗浄する
6. スライドの取付方法
   • 25から30 MowiolのμLまたは他のマウントソリューションを使用して標準的な顕微鏡スライド上にCYTOOのロゴとマウントCYTOOchip上CYTOOchipsを拾う。

4。顕微鏡のセットアップおよび自動化されたイメージの取得

多数の画像処理ソフトウェアパッケージは、その制御の高速自動化されたイメージの取得と表示のための顕微鏡が存在。この例では、Metamorphイメージングソフトウェアを使用し、自動買収は、CCD浜松のカメラとIntensilight水銀ファイバー照明器を搭載したニコンのEclipseのTi顕微鏡上で実行されます。画像はDAPI（核）、CY - 3（微細パターン）とFITC -ファロイジン（アクチン）に対応する三つの波長の20倍の倍率で取得されています。微細パターンの数はフィールドごとに可視化し、カメラと客観的なセットアップによって異なります。 CYTOOの微細パターンが大幅に買収を容易にチップ全体（100または130μm）で互いに一定間隔で配置されています。

1. 20倍の倍率を選択します。
2. オープン多次元取得（メニューバーにある：アプリ/多次元取得）と実験の異なるパラメータを設定します。
   • 波長の数：3
   • 波長の種類：DAPI、FITC、Cy3標識
   • 最初の細胞の分野に焦点を当て、それぞれの波長の露光時間を設定します。
   • オートフォーカスは、各波長で行うことができます。
   • データの保存先を選択
3. 12微細パターンを可視化し、カメラのフィールド（4つの列とパターンの3行）で中央になるようにCy3の波長と位置カメラを選択します。
4. 多次元買収を実行しているジャーナルを作成します。ジャーナルを作成するための手順は、図1で説明されています。
5. オープンスキャンステージの機能（メニューバーで：デバイス/ステージ/スキャンステージ）。 20倍の倍率で24枚、各含む12微細パターンを取得するには、-400μmのXステップサイズと300μmのYのステップサイズで6列と4行を入力してください。実行するように設定ジャーナルでは、ジャーナルMDA.JNLをアップロードする。その後、3つの波長のブロック全体の自動収集を開始するためにスキャンを押してください。
   注：ステップサイズがここに示されたXとYは、カメラのフィールドに存在する微細パターンの数に応じて異なります。設定してステージに応じて、Xおよび/またはYの方向は正しい方向への移動の負の値が必要になることがあります。

5。自動化された画像処理と解析

多くの画像処理と解析ソフトウェアパッケージが存在します。手順は以下のアウトライン画像処理とオープンソースプログラムのImageJ用に書かれた2カスタムメイドのマクロが実行する分析の手順を説明した。最初のマクロCellRefは、基準セル、細胞膜の第二の斜辺の対策の剛性/崩壊を作成します。両方はから入手可能ですwww.cytoo.com 。

1. 微細パターン（マクロCellRef）を中心にすべての3つのチャネルのための画像スタックを作成します。
   微細パターンの使用が大幅に個々の細胞の局在とセグメンテーションである自動化された画像処理の最初のステップを簡略化、セルのクラスタリングや凝集を避けることができます。蛍光標識された微細画像は微細パターンを中心とする領域を定義し、区切るために使用されます。これらの領域は、その後、他のチャネルで取得された画像の上に転置してトリミングされます。対応するトリミングされた画像は、各波長のスタックに組み立てられます。 RGB -スタックは、3つのチャンネル（図2）のマージから作成されます。
2. 単一のセル選択フィルタ（マクロCellRef）を適用する
   上に示したように、残りの微細パターンが空である一方、微細パターンの10〜30％（2000〜6500）は、単一または複数のセルによって占有されています。ちょうど単一のセルで使用する微細パターンを示す画像を選択するには、マクロは、画像あたりの核数を検出し、すべてのスタック（RGBと異なる波長の）複数の原子核あるいはまったく核（図3）を含むものからなくなります。
3. フィルタセル面積のオフカットを使用して、非正規化と完全に微細またがっていないセル排除（マクロCellRef）
   核のフィルタをエスケープしているという分裂細胞を除去するには、アクチンのためのFITCチャネルを使用して別のフィルタが適用されます。セル面積が計算され、特定のカットオフ以下のものが（間期細胞の面積の約2倍未満のセル領域）のすべてのスタックから削除されます。細胞エンベロープの面積は、パターンの大きさによって決定されます。
4. （マクロCellRef）細胞の画像を合わせます
   前の手順で、単一のmicropatを含む画像からterned細胞を選抜した。これらの画像は微細パターンを中心としているにもかかわらず、それらはすべて完璧に相互に整列されることはありません。画像処理を締結する、ImageJのプラグイン（MultiStackReg）は、収集されたすべての画像と微細位置に基づいてすべてのチャンネルを再編成に適用されます。このステップでは、現在、基準セルの単一細胞解析または作成（図4）に使用できる個々の画像の整列スタックを生成します。
5. 基準セル（マクロCellRef）を構築
   微細パターン上に成長する細胞はすべての細胞が同じような形状を持っていることを意味します。この正規化は、多くの細胞画像の正確な位置合わせとオーバーレイを許可します。スタック全体にわたって、各画像の信号を加算は、1つは"平均薬剤の効果を"可視化し、測定することができます。最終的な全体的な画像または基準セルは、表現と画像解析のためのユニークかつ有用なツールであり、唯一のマイクロパターン細胞（図4）で取得できます。 ImageJのでは、基準セルは、スタック（画像>スタック> Z -プロジェクト）からのフィルタリングと整列画像の投影を行うことによって構築されている。いくつかの投影法は、平均や最大強度として適用することができますが、通常は中央値投影は、画像スタックの主要な外れ値を排除どの選択されます。結果の検討を容易にするために、色分けされた周波数マップに単色画像に変換するLUTは、（ル​​ックアップテーブル）に適用されます。
6. 興味のあるパラメータ（マクロ斜辺）を測定し、定量
   フォームは、単一の主要なストレスファイバーにアクチン細胞骨格を整理するので、このビデオの記事では、L -微細パターンが使用されます。このようにアクチンを強調することによって、細胞骨格上blebbistatinの影響は多くの方法で決定することができます：またはストレスファイバーの強度、長さや太さを染色アクチンストレスファイバーの曲率の変化、、アクチンフィラメントの形態学的特徴の変化を測定する細胞の形状などをこれらのパラメータは、個々の細胞の画像や最終的な基準セル自体のいずれかで測定することができます。
   ここでは、5μMのblebbistatinの影響は第二ImageJのマクロの名前斜辺（図7）を使用して折りたたまれた細胞の数を数えることによって特徴付けられた。簡単に言えば、L -微細の閾値の画像は、細胞の三角形の形状の理論的な斜辺を定義するために使用されます。次に、アクチン染色像の閾値は、おおよその実際のセルの形状にするために実行されます。細胞の三角形と実際の凹面の細胞膜の理論的な斜辺の間の領域が測定される。細胞が崩壊したとき、理論上の斜辺の下の領域が表示されます。折りたたまれた細胞の割合は、対照及び処理条件を比較するために使用されます。

6。代表的な結果

どのような細胞の例としては、直ちに微細パターン上のようになるはずですし、1.6から1.8で説明されている重要な洗浄工程後の数時間は、図5に示されています。 CYTOOchipsで15分後、ラウンドHeLa細胞は、それらがフィブロネクチン微細パターン（図5a）に付着していることを示す等しい距離で観察される。細胞が培養容器の穏やかな揺れにもかかわらず、固定されたままにするときに接着が完了です。複数のセルによって占有される微細パターンの数を最小限に抑えるために、チップはその後cytophobic領域の上に浮遊細胞を除去するためにPBSでフラッシュされます。数時間後、完全に微細パターンを介して引き伸ばされているセルは、図5bに示されるもののようになります。

blebbistatin、固定およびアクチンと核の染色と細胞のインキュベーション後に得られる典型的な単一細胞の画像を図6に示されている。 ImageJのCellRefマクロを使用して複数の画像と画像処理の自動取得後に、色分けされた周波数マップはすべての細胞の画像（6c及び6F図）で平均化したアクチンの強さを描いたが生成されます。未処理と処理条件のための基準セルの比較は、研究対象の表現型を容易に観察するためのこのアプローチの可能性を示し、細胞の薬物効果を探索するのに特に便利です。

細胞に対するblebbistatinの効果の一解析例を図7に示されている。 ImageJの斜辺のマクロによって検出されたとして、5μMのblebbistatinで処理50コントロール細胞は50細胞で検出された折りたたまれた細胞（理論上の斜辺の下に存在する空白の領域を持つすなわちセル）の数が表示されます。 blebbistatin治療人口の折りたたまれた細胞数の増加は、ストレスファイバーや細胞内actinomyosin収縮力のblebbistatin阻害による細胞膜でそれ故に緊張の緩和を反映している。

図1。Metamorphで新しいジャーナルを作成する手順。

図自動画像処理の手順の2。フローチャート。

図3単一の細胞外にフィルタリング。

図4。基準セルを構築する。

図5。細胞播種。 A）HeLa細胞は、B）HeLa細胞、Lの微細パターン（10倍の倍率）に拡散を完全にした後にフラッシュステップ（4倍）した後、微細パターンに付着。

図6。制御と薬剤処理条件でnonpatternedとマイクロパターン細胞の比較。 HeLa細胞を3時間播種し、5μMの1時間blebbistatin（下のパネル）または左の未処理（パネル上）で処理した。制御nonpatterned細胞（）で、アクチンは、5μMのblebbistatin（D）を用いた治療によりいつの間にか逆アセンブル、複数のファイバに組み立てます。 L -微細パターンでは、対照細胞は三角形の形状（b）を採用し、nonpatterned細胞（D）と比較するとL.の2頂の間に主要なアクチン繊維（ストレスファイバー）を開発、blebbistatinはL -マイクロパターン上での主要な表現型の変化を誘発するセル（E）。直接薬の効果の可視化と制御及び処理条件の比較は、20細胞から構築された基準セルのプレゼンテーションを迅速に可視化することができます。 blebbistatin処理した細胞の崩壊と主要なストレスファイバー（f）が消えるしながら個々のセルと同様に、明確かつ強烈なストレスファイバーは、コントロールの基準セル（C）上に存在する。

図7。マクロHypothenuseを使用して、細胞に対するblebbistatinの影響の解析の例。コントロール細胞の25％が縮小されたが、これは弱体化actinomyosin収縮ネットワーク（N = 50セル）を反映した5μMのblebbistatin処理した細胞では75％に3倍に増加した。

Discussion

微細の選択

5μMのblebbistatinの効果は標準的な文化をサポートする上でかろうじて検出可能であるが、効率的な定量化は、単一の主要なストレスファイバーにアクチンの集中微細パターンで可能です。これは、セル上blebbistatin効果の正確な定量を助けるアクチン細胞骨格の可視化を強化。微細形状の選択は、アッセイの設計において重要であるとの研究で強調表示される表現型の変化に応じて設計されています。

結論

微細パターンは、特に低濃度で、薬の効果の可視化と定量化を促進する。セルベースアッセイ用接着剤微細パターンを持つ均一な平面基板の交換は、生成されるデータの正確性、感度と品質を向上させます。その結果、より少ない細胞を³堅牢な統計的な成果を達成するために、分析のために必要とされる。接着剤微細パターンは、機能的研究を改善し、毒性または間接的な薬の効果を誘導すること避けるために低い薬剤濃度での表現型の変化を探索するための真の機会を提供する。適切なスクリーニングプラットフォームが使用されている場合は、微細パターンは、遺伝子/薬剤スクリーニングのアプリケーションを改善するための製薬企業の要求に応えることができます。携帯電話の現象を分析し、定量化するための微細パターンを悪用している最近の出版物のいくつかの追加の例は^、3月13日の下に引用されている。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前		会社	カタログ番号	コメント
細胞の培養
CYTOOchips 20 × 20 ​​LM - FN		CYTOO	10から114	CYTOOchipsは、お好みのタンパク質の吸着のために用意されています
PBS 1X		ギブコ	14040-091
チャンバー（Kovaのスライド）を数える		Prolabo	71287.01
DMEM/F-12 +グルタミン- I		GIBCO -インビトロジェン	25300-054
FBS（F TALウシ血清）		PAA	31331-028
ペニシリン＆ストレプトマイシン		PAA	A15 - 101
6ウェルプレート		Dutscher	353046
遠心		フィッシャーサイエンティフィック	M65838
顕微鏡		ニコン
薬物、固定および免疫染色
細胞骨格バッファ1X（CB）		シグマ	MES：M8250 塩化カリウム：I2636 のMgCl：M2393 EGTA：E3889	10mMのMES pHは6.1、FRとものKCl、 3MMのMgCl、 2mMのEGTA
スクロース		シグマ	S2395
PFA 32パーセント		電子顕微鏡学	15714
PFA 5パーセント				CB 1.185X 54 mLでPFA 32％の10mLを混ぜる
トリトン- X100		シグマ	T9284
PBSの錠剤		GIBCO -インビトロジェン	18912-014
アルブミンBovin血清（BSA）		シグマ	A7806
Phallodin - FITC		シグマ	P5282
Hoescht		インビトロジェン	H3570
Blebbistatin		Euromedex	BN0640
DMSO		シグマ	D8418
NH 4 Clの 0.1M		シグマ	M11209
画像収集
落射蛍光顕微鏡		ニコン	EclipseのTiの
CCDカメラ		TBC	TBC
ImageJのソフトウェア		http://rsbweb.nih.gov/ij/