膀胱腫瘍は、カテーテル、局所焼灼、および火傷のサイトへの癌細胞のその後の付着を介して低侵襲的にメスのマウスで確立されている。
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この記事について
サマリー
要約
この簡単な手順では、膀胱腫瘍は、カテーテルの使用、地元の焼灼、およびその後の細胞接着を介して雌C57マウスで確立されています。彼らの膀胱は尿道カテーテルを挿入し、排水された後、動物は再び尿道や膀胱を損傷することなく、膀胱に白金線の挿入を可能にするためにカテーテルをされています。カテーテルは、火傷を作成するために膀胱内に電流を導通されるワイヤーのための絶縁体として機能するようにテフロンで作られています。電気焼灼器ユニットは、細胞外の層を離れて燃焼し、その後のカテーテルを通して膀胱に懸濁液に配信される癌細胞のための付着部位を提供し、ワイヤの露出終わりに2.5W提供する目的で使用されます。細胞は、カテーテルを除去した後、90分間膀胱、そして自然に排出することを許可膀胱内に残ります。腫瘍の発達は、超音波を介して監視されます。特定の注意は、添付のビデオではカテーテル挿入のテクニックに支払われます。
プロトコル
1。動物
- 雌C57BL/6J、マウス（ ハツカネズミ ） は出荷前にベンダーによって17ネズミのウイルスに感染外部寄生虫、寄生虫endoparasites、および抗体の自由検証されます。マウスは実験動物の管理と利用のためのガイドに従い、Tulane大学のAAALAC認定の動物施設に収容されています1。
- 具体的には、マウスは、広葉樹の寝具で個別に換気されたポリカーボネートcageswithのmicroisolationフィルタートップに収容されたグループ（4-5匹/ケージ）です。彼らはアドリブでペレット化げっ歯類の食品や水道水を提供しています。
- マウスは、7日間は、研究開始前に順応さが許可されます。
2。細胞
- マウス移行上皮癌細胞株MB49は、膀胱腫瘍を生成するために使用されます。
- 細胞は、10％ウシ胎児血清、100単位/ mlペニシリン、および100単位/ mlストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地で培養されています。
- 培養は37℃とメディアの変化と、5％CO 2、2〜3日間維持されます。
3。動物同所性腫瘍モデル
ここで説明する膀胱腫瘍モデルの点眼ギュンターらによって記載された手順の変更です。2
- 麻酔は酸素にイソフルラン2％（MWI / VetOne、メリディアン、ID、カタログ番号501017）で誘導し、0.75から1.25パーセントに維持されている。 （複数の動物をイソフルラン濃度の上昇を必要となる、これを同時に治療することができます。）角膜乾燥を防ぐために、目には人工涙液の眼軟膏で潤滑されています。体の熱は、紙のドレープの下で加熱パッドで維持されます。
- 腰の毛皮は、金属製の接地板との接触を促進するためにクリップされて、そして剃毛面積はelectroconductionゲルでコーティングされています。
- 各マウスは、個別に金属の接地板上に背recumbancyに置かれ、膀胱は尿道、3 / 4インチ、店頭針IVのカテーテルが除去スタイレットで潤滑、24ゲージを使用してカテーテルをしています。
- 膀胱は、尿から排出される、と白金線は、カテーテルの両端に導線が残して膀胱にカテーテルを通して挿入される - カテーテルの内腔の端の約2 mm。ワイヤーは、プラチナのために酸化に対する材料の抵抗で作られています。
- 2.5 Wの現在は、凝固に設定された電気焼灼器ユニットと線の外側部分に触れて、約0.5秒のために膀胱に適用されます。
- ワイヤーは、膀胱内の別の場所や適用別の2.5 Wの充電に移動されます。
- 線は削除され、1 × 10 6細胞/ mlの濃度でMB49細胞の100μlを1ミリリットルシリンジを介して膀胱内にカテーテルを介して染み込ませています。
- シリンジは、細胞懸濁液の流出を防ぐために、カテーテルに接続されたままになり、カテーテルを挿入したマウスは、細胞が火傷のサイトに接続できるように90分間麻酔下で維持されています。
- 無菌生理食塩水の100〜200μlのは、リカバリの前に、各マウスにIP注射によって投与される。
- 潜伏期間の終了時にカテーテルが除去され、動物は、マウスは自分のホームケージに戻される時点で、立直り反射戻り、まで加熱されたパッドの上に回復するために許可されています。
4。超音波検査
- 腫瘍はマウスは腫瘍の成長を監視するために膀胱の超音波検査を受ける前に3-5日のために拡張されます。
- 上記のような初期の超音波検査の場合、動物は麻酔する。マウスは、背側recumbancyに配置され、腹部の皮膚は、毛皮をクリッピングすることによって調製される。
- 24ゲージ静脈カテーテルを膀胱に尿道に挿入されます。この時点で、膀胱を排出し、尿は、さらなる分析のために収集することができます。
- 無菌生理食塩水100μlの超音波検査で膀胱の視認性を向上させるためにカテーテルを介して膀胱に滴下される。
- 超音波伝導ゲルを腹部に適用され、超音波検査は、膀胱壁と内腔を評価するために実行されます。
5。代表的な結果：
腫瘍組織はinnoculation後3-5日表示されるようになります。 5日目で - 私たちの経験では、12匹のマウスの群で、より日常的に50％以上は、（1.0μL、V =π/ 6 · L · W · Hを使用して、0.5）膀胱内で検出可能な組織の塊を持っている。メガバイト49細胞を使用する場合は、腫瘍のサイズは増大し続け、マウスは未処理行けば安楽死は、24日目で必要となります。マウスは、無気力や悪液質になったときに安楽死が推奨されて、フリルの毛皮、ハンチング、および無応答の動作、またはときに彼らは彼らの初期の体重の20％を失うが表示されます。
腫瘍は急速に成長し、発展途上腫瘍の細胞が血管新生の血液供給によって保守することができるものよりも速く増殖するので、彼らは表向きは200ミリグラム以上、3のマスに到達した後に壊死のセンターを持つことになります。一つは、また間接的におそらく発展途上腫瘍内に急速な血管新生に関連しているhematurea、のレベルを介して腫瘍の進行を監視することができます。それは一貫して未治療の腫瘍を有するマウスの尿は14日目で血液が含まれていることが指摘された。赤血球の濃度は、これらのマウスでは、時間の経過とともに増加する現れ、尿の量が減少集めた。 50 mgを超える腫瘍はまた、典型的に14日後のinnoculationによって、比較的容易に触診できる。
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ディスカッション
異なる結果が予想される必要がありますが、雌マウスに同所性膀胱腫瘍を確立するのこの低侵襲法は、MB49以外の細胞型に対しても適用できます。あまり積極的な腫瘍細胞が使用されている場合、（新たな最適条件を確立するために0.5 W刻みを使用して）わずかにワット数を大きくすると、腫瘍細胞の接着に、より従順エリアをもたらすでしょう、と染み込ませ、細胞のための長い膀胱のインキュベーション時間は、より多くの量のを得られますやけどのサイト（未発表データ）での細胞接着。一部のプロトコルは、電気焼灼、2を介して10 Wを実現するお勧めしますがこれだけの電力が上限を考慮すべきである、とおそらく完全に避けること。他の細胞型が使用されているときに配信細胞の濃度を増加させることも成功のチャンスを増やすことができます。
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開示事項
動物実験は、Tulane大学のインスティテューショナルケアと使用委員会によって定められたガイドラインおよび規制に準拠して行った。
謝辞
この作品は、全米科学財団のキャリア賞（CBET - 0846395）と比較医学科、Tulane大学によって資金を供給された。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| C57Bl/6J マウス | Jackson Laboratory | 000664 | 3-5週齢 |
| ポリカーボネート製ケージおよび換気ラック | Lab Products | Super Mouse 750 | 327mm x 190mm x 143mm |
| ハードウッド製敷材 | Harlan Laboratories | Laboratory –grade SaniChips | |
| げっ歯類用飼料 | Harlan Laboratories | Rodent Diet 2019 | |
| 静脈カテーテル | MWI Veterinary Supply | 009231 | 24 G x ¾ in. |
| 電気焼灼装置 | Bovie Medical Corporation | Aaron 900 | |
| 超音波診断装置 | Sonosite | 180 Plus (Vet) | |
| MB49細胞株 | Wake Forest University Baptist Medical Center | N.A. | |
| DMEM | Invitrogen | 21063-029 | |
| ウシ胎児血清 | Gemini Bio Products | 100106 500A57B | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | Invitrogen | 15140-163 |
参考文献
- Institute of Laboratory Animal Resources. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , National Academies Press. Washington, DC. (1996).
- Gunther, J. H., Jurczok, A., Wulf, T., Brandau, S., Deinert, I., Jocham, D. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
- Zhang, X., Atala, A., Godbey, W. T. Expression-targeted gene therapy for the treatment of transitional cell carcinoma. Cancer Gene Ther. 15, 543-552 (2008).
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