ELISAによるネイティブ無傷ヌクレオソーム上の翻訳後修飾の検出

Summary

ヌクレオソームELISA（NU - ELISA）は、ネイティブ、無傷のヌクレオソームの調製品で、翻訳後修飾のグローバルなパターンを検出する高感度かつ定量的な方法です。これらの変更は、メチル化、アセチル化、および特定のヒストンのアミノ酸残基でリン酸化が含まれており、それ故にNU - ELISAは、特定の細胞型の総合的なクロマチンの修飾状態のグローバルプロテオミクスアッセイを提供する。

Abstract

真核生物のゲノムは、DNAとタンパク質の両方を含むクロマチンとして存在する。クロマチンの基本単位は2つのヒストンH2A、H2B、H3、およびH4 ¹のそれぞれに関連付けられているDNAの146塩基対を含むヌクレオソーム、です。ヒストンのN末端尾部には、リジンとアルギニンに富み、アセチル化、メチル化、および他の翻訳後修飾（PTMS）によって転写後に変更されます。ヌクレオソームのPTMの構成は、このような性質^2,3におけるエピジェネティックな遺伝子調節のモードを提供し、関連するDNAの転写活性に影響を与えることができます。我々はヌクレオソームELISA（NU - ELISA）は定量的に細胞から抽出したヌクレオソームのグローバルPTMの署名を決定するという方法を開発した。 NU - ELISAはウェスタンブロット法よりも感度が高く定量的であり、そして特定の細胞型のepiproteomic状態を調べるために便利です。このビデオジャーナルの記事では、NU - ELISA解析を実行する詳細な手順を示しています。

Protocol

1。哺乳動物細胞培養

NU - ELISAは、培養で増殖することができます任意の哺乳動物細胞の種類に実行することができます。そこで我々は、いくつかの異なる抗体（ABS）でアッセイを可能にする、ヌクレオソームがいくつかの同じロードされたELISAプレートを準備するのに十分な量で単離することができるように、細胞の大規模なバッチに適度な準備をすることを好む。以下の培養スケールでは十分な材料を提供します。

マウスembyronic幹細胞は、フィーダー細胞なしで細胞の1つまたは2つの15cmのプレートを成長させる。線維芽細胞の場合は、合流するために5〜10 15 cmのプレートを成長させる。

2。原子核のアイソレーション

注：すべてのステップが示されている場合を除き、あらかじめ冷却した緩衝液で氷の上です。

1. プレート当たり3 mlのトリプシンで細胞をトリプシン処理、結合、および氷冷PBS /酪酸の20 mlを加える。 5分間1000rpmで遠心する。
2. 10ミリリットルのPBS /酪酸、5分間1000rpmで遠心分離で細胞を再懸濁します。
3. プロテアーゼ阻害剤（Sigma - Aldrich社P - 8340）4 mlの溶解バッファーで再懸濁します。氷の上でタイプBの乳棒で20ストロークを均質化するダウンス。
4. で10分間4℃で2000グラムで遠心分離（上清は、このプロトコルのために必要されていない細胞質が、含まれているが、必要であればそれは他の用途のために保存することができます）。
5. 2ミリリットルの氷冷洗浄緩衝液C（プロテアーゼ阻害剤を含む）でペレットを再懸濁します。
6. レイヤ5ミリリットル、30％ショ糖クッション上に再懸濁した物質は、その後、スイングバケットローターで5分間2400グラムで遠心。核はクッションを通って移動し、破片は、インターフェイスのままです。
7. 慎重にすべての液体のボリュームを削除し、250μlの氷冷洗浄緩衝液C +プロテアーゼ阻害剤の核を再懸濁します。

3。 その場でミクロコッカスヌクレアーゼ（MNase）消化のでヌクレオソームの単離

我々はクロマチンが上清に遊離無傷ヌクレオソームを駆動する低張処理することにより、MNaseでそれらを導入することで、核内にその場で消化されているプロシージャを使用してください。

1. サンプルに3μlの0.1 M CaCl _2を追加。 37℃のヒートブロックに入れ。 37℃の温度を仮定することができます。
2. 2台のMNaseを（ミクロコッカスヌクレアーゼ、シグマアルドリッチ、MNaseバッファの2units/10μlで溶解）を追加、その後37℃のためにインキュベートしますピペットチップを使用して頻繁に混合しながら12分間のCを、。
3. 反応を停止するには、0.5MのNa - EDTA、pH8.0の6μlを添加する。氷上に置く。
4. 4分間2000グラムで遠心分離、上清を捨てる。 300μlの0.2mMののNa - EDTAでペレットを再懸濁する。時折優しいペッティングで1時間氷上で保存する。 （これらの低張条件は核から遊離ヌクレオソームを解放）。
5. 4℃で4分間3000gで遠心する℃、氷の上で、自由なヌクレオソームを含む上清を、保存します。
6. 300μlの0.2mMののNa - EDTAで再び沈殿を再懸濁します。時折優しいペッティングで1時間氷上で保存する。
7. 4℃で4分のために3000グラムで遠心分離℃を上清を保持し、手順5からの最初の上清と組み合わせる。結果mononucleosome製剤は-80℃で分注し、保存することができます。

注：クロマチンの量が粗雑に10μlのサンプルの260nmの吸光度を測定することによって定量することができる水990μlに追加。 ₂₆₀ = 10（1 / 100希釈を調整後）クロマチンの約1mg/mlに相当する。主に長さが146塩基のDNAが含まれていなければなりませんMNase消化の質と程度を、監視するために彼らのDNAの含量のためにも、上記の手順の間に、少量のサンプルが保持される場合があるので、後で分析する。ラダリング型は、不完全なMNase消化の指標である。

注：図1は、核の分離とMNase消化の手順の図示した要約が含まれています。

4。ヌクレオソーム- ELISA（NU - ELISA）

我々は、96ウェルELISAマイクロタイタープレート上に固定されているネイティブそのままnuclesosomesを含有する画分にPTMSを検出する。各サンプルについて、我々は2倍希釈系列を作り、これらは三連のウェル上にコーティングされています。

1. 4 °50μl/ウェルのコーティング緩衝液で希釈したヌクレオソームとC。一晩コートMaxiSorpプレートヌクレオソームの提案されたシリアル倍の希釈液を底部で唯一のコーティング緩衝液（0μgのクロマチン）を、0.1μgの、濃度0.05μg、0.025μgの、0.0125μgの、0.00625μgの、0.00313μgの、0.00156μgを追加することによって、下の行に一番上の行から調製される行。 （注：プレートのカバーは、このステップのために必要です。）
2. 午前中に、プレート洗浄機で10分間の合計のために室温（RT）で200μl/ウェルPBS/0.5％ツイーン20でプレートを4回洗浄する。
3. 100μl/ウェルPBS/0.05％のTween - 20 / 5％BSAで室温でブロック1時間。
4. 活発に反転プレートを振とうしてブロッキングバッファーを除去するシンク上。カバーと-20℃でプレートを保存したり、次の手順に進みます。
5. PBS/0.05％ローテーターで室温で1時間インキュベートのTween - 20 / 5％BSA、50も希釈/μL1:1000の体積（または必要に応じて）に1 · ABSを追加。
6. 室温とプレートウォッシャーで10分の合計のための200μl/ウェルPBS/0.5％ツイーン20でプレートを4回洗浄する。
7. ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）標識2 °腹筋、PBS/0.05％ローテーター上で時間室温でのTween - 20 / 5％BSAで（または必要に応じて）1:5000に希釈を追加。
8. 200μl/ウェルPBS/0.5％ツイーン20でプレートを4回洗浄する。各洗浄には、プレートウォッシャーを使用して室温で10分の合計です。
9. 室温で10分間各ウェルにTMB基質50μlを加えてプレートを開発する。 H ₂ SO ₄を50μlを添加することにより/よく2Nの反応を停止し、プレートを450 nmのを読んで。 （ヒント：前の読書吸光度に井戸の気泡を放​​散するためにプレートのローターを使用して2分間1500rpmで遠心分離）。
10. 定量的および統計的分析のためのスプレッドシートファイルへの読み取り値をエクスポートします。

試薬

PBS /酪酸

135 mM NaClを

2.5mMのKClを

8ミリのNa 2 HPO 4

1.5mMのKH 2 PO 4

の10mMのNa -酪酸

溶解バッファー

250mMスクロース

10mMトリス- HCl、pH7.4の

の10mMのNa -酪酸

4mMのMgCl 2の

0.1％トリトンX - 100

洗浄バッファーC

250mMスクロース

10mMトリス- HCl、pH7.4の

の10mMのNa -酪酸

4mMのMgCl 2の

ショ糖クッション

洗浄バッファーCで30％（w / v）スクロース

Microccocalヌクレアーゼ緩衝剤

5mMのナポ4緩衝液、pH 7.0の

0.025ミリメートルのCaCl 2

コーティング緩衝液

80ミリリットルの溶液A + 170ミリリットル溶液B + 250ミリリットルのdH 2 O

解決策：0.2 M Na 2 CO 3の

B液：0.2 M NaHCO 3を

5。代表的な結果

NU - ELISA法を用いて、複数の同一のプレートのシリーズはmononucleosomesの形で準備したクロマチンで読み込むことができる準備されています。我々は通常、それぞれが異なる抗PTM特異的抗体（ABS）でプローブすることができるように同一にロードされたプレートのシリーズを用意。我々はまた、常に、その修正の状態合計クロマチンのローディングコントロールに関係なく、ヒストンを検出する抗体でプローブすることができますプレートを準備。このコントロールは、後で定量的に異なる試料から調製したヌクレオソームのPTM内容を比較するために不可欠です。我々はこのアプローチを使用して生の吸光度値を修正特定のクロマチンサンプル内PTMSのレベルを定量するために：まず、ないクロマチンを（背景は通常無視できる）含まないコントロールウェルから得られた値を使用して、任意のバックグラウンド信号を引きます。私たちは、その後、その修正の状態に関係なく、ヌクレオソームを検出する抗体をアッセイした同じロードされたプレートから入手したNU - ELISAの結果にPTM -特定の信号を標準化する。 （我々はこの目的のためにヒストンH2AまたはH2Bに特異的なポリクローナルAbsを使用している）。私たちは、その後、クロマチンの各希釈に平均値と分散を決定し、そしてELISAアッセイの直線部分から得られたデータを使用してください。 NU - ELISAの数学と統計分析の詳細な例は、以前は次の⁴報告されている

図1。 NU - ELISAの手順の概略diagam。 A.哺乳動物細胞を収穫している、B.の核はダウンスhで細胞から分離されていますomogenization、C.は、細胞を遠心分離後、30％w / vのスクロースクッション、D.の上にロードされている混乱、核はペレット内に堆積され、E、FのクロマチンはMNaseによって主にmononucleomesにその場で消化され、G、H 、私 。可溶性mononucleosomesは低張処理し、残留核物質の繰り返し遠心分離によって抽出されます。J.の Mononucleosomesは異なる試料から（ラベルはSAMP。この場合は1と2）は同じロードされたプレートのシリーズでマイクロタイターウェルにコーティングして尋問されています合計クロマチンの負荷を決定するためにPTM -固有の腹筋とPTM -独立の腹筋。そのPTM内容が異なる2つのサンプルに差動信号の検出レベルのK.の描写が、まだ、抗H2B免疫反応性によって判断、同じような全体的なクロマチンのコンテンツを持っている。

Discussion

NU - ELISAは、特定の細胞型内に存在するヌクレオソームPTMSのグローバルステータスを確認する方法を提供する。 NU - ELISAの研究は世界的なヌクレオソーム変更の状態が発散細胞型⁴の比較で異なることが示されている。細胞はトリコスタチンA -またはときにマウスembyronicの幹細胞は^4を差別化しているなどのエピジェネティックな調節剤にさらされているときに加えて、NU - ELISA PTMのプロファイルが変更されます。方法はまた、ヒトES細胞⁵のクロマチンを研究するために正常に適用されています。 NU - ELISAは、現在の形で、細胞のエピゲノムの合計内に存在するPTMSの唯一のコンポジット署名を検出することができるに注意する必要があります。これは、特定の遺伝子座における特定のPTMの分布を決定することができるゲノムワイドなクロマチン免疫沈降、と著しく異なります。

NU - ELISAの手順の最初のステップは、哺乳動物の核^6,7からmononucleosomesを分離する従来の方法を適合させたもの。これらの適応の方法は、哺乳動物細胞から高品質の無傷mononucleosomesを得るために好都合な方法を提供し、得られた画分は、クロマチンコンテンツで包括的ですが、追加の核物質が大量に含まれています。特定の腹筋が使用されているので、混入非ヌクレオソーム材料は、高い純度を必要とする量産仕様のアプローチとは異なり、NU - ELISAアッセイで忍容性は良好です。しかし、NU - ELISAは、西部が西部劇とヌクレオソームPTMSの検出のための質量分析に優れた代替手段を提供するので^、4ブロッティングよりも高感度かつ定量的です。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
ミクロコッカスNucleae	シグマ	N3755	-20℃で保存し、2U/10μlバッファのアリコートを作る
ヌンクMAXISORPマイクロタイタープレート	フィッシャー	12-565-135	接着プレートカバーもフィッシャーを通じて注文することができます
自動化されたプレートウォッシャー
1ステップTMB - ELISA基質	ピアース	34028	4℃で使用前に室温に事前暖かいまたは仕様書で指示
マイクロタイタープレートリーダー	Bio - Rad社製マイクロプレートリーダー（モデル：680）		ほとんどの比色プレートリーダーのモデルが適しています。