生存細胞の正確な数の知識は、多くの組織培養の操作が必要です。このプロトコルは、生細胞と死細胞を区別し、血球計算盤を用いて細胞を定量化する方法について説明します。それはヒト神経幹/前駆細胞（hNSPCsを）数えて説明していますが、それは他の細胞型に使用することができます。
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この記事について
サマリー
要約
細胞懸濁液の所定量中の生細胞の正確な数の知識は、このような免疫細胞または細胞のトランスフェクションに用いる細胞を播き、多くの日常的な組織培養の操作、が必要です。このプロトコルは、生細胞と死細胞を区別し、細胞濃度と血球計を用いて全細胞数を定量化するための簡単かつ迅速な方法を説明します。この手順は、最初の成長表面から細胞をデタッチし、メディアでそれらを再懸濁する必要があります。次に、細胞をトリパンブルー（理想的には象限当たり20から50まで細胞を与える濃度まで）の溶液で希釈し、血球計算盤に配置されます。最後に、1つの1 MM 2象限（0.1μL）および希釈係数を掛けるの体積で平均を割って、いくつかのランダムに選ばれた象限に生存細胞の数を平均化L.当たりのセル数を与える液中の総体積でこの細胞濃度を掛け合わせると総細胞数を与えます。このプロトコルは、ヒト神経幹/前駆細胞（hNSPCsを）数えて説明するだけでなく、他の多くの細胞種に使用することができます。
プロトコル
ヒト神経幹細胞を継代
注 ：を参照してください継代ヒト神経幹細胞の 細胞をデタッチして再懸濁させる方法についての記事。 https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263
カウントのために細胞懸濁液を準備する
- 0.4％トリパンブルー溶液を、エッペンドルフチューブに細胞培地の20μlの代わりに25μlの。
- 優しく均一な懸濁液を作成するためにメディアの知られているボリュームで細胞を含むチューブをタップしてカウントされる細胞を再懸濁します。前のステップからエッペンドルフチューブに細胞を5μlを置きます。このステップでは、10倍の細胞の濃度を希釈する。
- 血球計算盤にカバーガラスを置き、細胞懸濁液11〜12μlを約読み込みます。
血球計算盤で細胞をカウントする
- 位相差顕微鏡で血球計のグリッド全体を観察。グリッドの一象限（赤などのものなど）に焦点を当てる。
- その膜が損傷し、トリパンブルー色素を除外することができないされているため、死または死細胞は青色表示されます。生細胞は青色表示されず、位相コントラストの光の"ハロ"（"フェーズ明るい"となる）で囲まれます。
- つの象限（領域1 mm 2）の中の生存細胞数を数える。また、セルの合計数によって生存細胞の数を割ることによって細胞の生存率を決定することができます。 3月4日ランダム象限で細胞をカウントし、象限当たりの細胞の平均数を決定します。象限のボリュームが10 -4 mlまたは0.1μLであることが知られているので、細胞の濃度を決定することができます。
- あなたは、＃細胞/μlを決定するために次のショートカットを使用することができます。
チューブの＃チューブ内のセルの合計=＃細胞/μlのXμL
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ディスカッション
このプロトコルは、細胞を伴う実験の様々な細胞濃度を決定するために簡単かつ迅速な方法を説明します。 3Dで説明されているショートカットを使用して、一つは迅速かつ正確に細胞濃度と指定されたボリュームの総細胞数を決定することができます。
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謝辞
著者らは、子供の病院、hNSPC文化を提供するためのオレンジカウンティ研究所で国立ヒト神経幹細胞資源の博士フィリップH.シュワルツ氏に感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント | |
|---|---|---|---|---|
| 位相差血球計数器 | 器具 | Hausser Scientific | 02-671-54 | 記載のカタログ番号でFisherより販売 |
| トリパンブルー染色液 0.4% | 試薬 | GIBCO, by Life Technologies | 15250-061 | 記載のカタログ番号でInvitrogenより販売 |
参考文献
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 (2007).
- Caprette, D. avidR. Using a Hemacytometer. BioEd Online. , http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer&dpg=3 (2008).
- Caprette, D. avidR. Counting Chamber (Hemacytometer). BioEd Online. , http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer%22&dpg=2 (2008).
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再版と許可
