二分子蛍光相補

Summary

タンパク質の細胞内局在は、細胞シグナル伝達の時空間制御を決定する上で重要です。ここで、我々は、細胞内のタンパク質の空間的な相互作用を監視するための簡単​​な方法として、二分子蛍光相補（BiFC）を記述する。

Abstract

シグナル伝達複合体の細胞内分布を定義すると、その複合体からの出力を理解する上で不可欠です。 このような免疫沈降などの従来の方法は、複合体の空間的局在に関する情報を提供していません。対照的に、BiFCはタンパク質複合体の相互作用と細胞内局在を監視します。この方法では、fluororescentタンパク質は、関心のある2つのタンパク質に融合されているアミノおよびカルボキシ末端に非蛍光フラグメントに分割されます。蛍光体の再構成におけるタンパク質の結果の相互作用（図^1）1,2。 BiFCの制限は、断片化された蛍光体が再構成されると、複雑な³不可逆であるということです。この制限は、一時的または弱い相互作用を検出するのに有利であるが、複雑なダイナミクスの動態解析を排除する。追加の注意点は、再構成されたflourophoreが再びリアルタイムの相互作用⁴の観察を排除、成熟し、蛍光を発するために30分必要があるということです。タンパク質相互作用^5,6：BiFCはそのような緑色蛍光タンパク質変異などのレポータータンパク質（BiFC）、ジヒドロ葉酸還元酵素、β-ラクタマーゼ、および蛋白質を測定するルシフェラーゼを採用した蛋白質フラグメントの相補アッセイ（PCA）の具体例です。蛋白質研究するために代替方法：細胞内のタンパク質の相互作用は、蛍光共局在し、フェルスター共鳴エネルギー移動^{（FRET）7が}含まれ^ています。共局在のために、二つのタンパク質は、個別に直接蛍光体でまたは間接蛍光抗体のいずれかによってタグ付けされます。しかし、このアプローチは、それが困難な共局在のデータを解釈すること、非相互作用するタンパク質の高いバックグラウンドにつながります。さらに、共焦点顕微鏡の分解能の限界のため、2つのタンパク質は必ずしも相互に作用することなく、共局在表示されることがあります。興味のある2つのタンパク質が相互作用するときBiFCで、蛍光のみが観察される。タンパク質相互作用が、技術的に挑戦することができます：FRETはタンパク質を研究するための別の優れた方法です。 FRETの実験では、ドナーとアクセプターは、細胞内で同様の明るさと化学量論であることが必要です。さらに、一つはアクセプターチャネルとその逆にドナーの通過ブ​​リードを考慮する必要があります。 FRETのとは異なり、BiFCは、画像データの少ないバックグラウンド蛍光、少し後処理を有し、高い過剰発現を必要とせず、弱または一時的な相互作用を検出することができます。生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）はドナーがそれによって刺激的なアクセプター発光になるために基質を触媒する酵素（例えばルシフェラーゼ）であることを除いてFRETを同様の方法です。 BRETは、スルーブリードの技術的な問題や高いバックグラウンドの蛍光を欠いていることもありましたが、特定のコンパートメント^8〜基板の局在の欠如に空間的な情報を提供する能力を欠いている。全体的に、BiFCは区分シグナリングへの洞察を得るためにタンパク質複合体の細胞内局在を可視化するための優れた方法です。

Protocol

A. BiFCキャリブレーション

1. 蛍光体を選択してください。BiFC融合パートナー（表1）としてうまく機能などYFPや金星など、複数の蛍光体が、、ある。 YFP BiFCフラグメントは蛍光体の形成^2を容易にするために30℃でプレインキュベーションを必要としながら金星のアミノおよびカルボキシ末端の末端は、37℃での複合体を形成することが可能です。低い温度でこのインキュベーションは、いくつかの細胞プロセスを変更することがありますし、フラグメントを選択する際に考慮する必要があります。タンパク質のカルボキシ末端に融合させる金星のためのベクターは、Addgene（から入手できますhttp://www.addgene.org/pgvec1 、コントロールとして使用するための構造体が追加、などと一緒に、seepBiFC - VN173とpBiFC - VC155） pBiFC - bJunVN173とpBiFC - bFosVC155 ^2。アミノ末端金星のベクトル（pFLAG - VN173およびPHA - VC155）を含む追加のベクトルは、、以下のサイトから入手できます。

Discussion

細胞全体のタンパク質の相互作用およびこれらの複合体の細胞内局在を決定する：BiFCは、タンパク質を可視化するための優れた方法です。 BiFCの利点は唯一相互作用するタンパク質は、蛍光、過渡的な相互作用が安定しているか、および画像データの後処理が最小である。ということですこのメソッドの2つの欠点は、蛍光団と蛍光団複合体の不可逆性のための成熟の時間です。一部のアプリケーション下では、この不可逆性は利点として使用することができます。例えば、一つは構成的活性化の結果、BiFC複雑で酵素やその酵素の活性化剤を使用することができます。一つは、タンパク質がこの複合体に動員されるかを決定することができます。さらに、BiFC複合体の不可逆性は、弱いまたは一時的な相互作用の同定が可能になります。適切なコントロールがBiFC実験の解釈のために重要である。空のBiFCベクトルは高いバックグラウンド蛍光のこれらの試薬の結果として、コントロールとして使用しないでください。適切なコントロールには、2つのタンパク質の相互作用をブロックすることが知られている目的のタンパク質のいずれかの変異を使用して含まれています。目的のタンパク質との複合体ではない無関係のタンパク質を使.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Cellgro	10-013
ウシ胎児血清	Cellgro	35-011-CV
ガラス底 マイクロウェルディッシュ	Matek	P35G-1.5-14C
6ウェルディッシュ	Falcon BD	35-3846
Lipofectamine	Invitrogen	18324020
PBS	Cellgro	21-031-CV
パラホルムアルデヒド	Sigma-Aldrich	P6148
共焦点顕微鏡	Carl Zeiss, Inc.	LSM510メタ