Method Article

偏上皮細胞へのプラスミドのマイクロインジェクションによる低分子量GTPaseの機能を解析する

DOI:

10.3791/2645

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May 31st, 2011

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1Department of Cell and Molecular Biology, Northwestern University

In This Article

Summary

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この記事では詳細はマイクロインジェクション法を用いて偏光上皮細胞における低分子量GTPaseの過剰発現と解析に関わる手順を。

Abstract

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頂端部が"無料"の表面と側底膜に直面している生化学的及び機能的に異なる心尖部と側底部領域にそれらの形質膜分極上皮細胞は、基板と隣接セルに接触している。両方の膜ドメインは、拡散障壁を形成するタイトジャンクショ​​ン、で区切られています。このようなマディン-ダービーのような上皮細胞イヌ腎臓（MDCK）細胞はポリカーボネートフィルターに高密度で播種し、1 2、数日間培養する。アピカル-基底外側偏光は、培養に成功しrecapitulatedすることができます細胞極性の確立と維持は、RalA、Cdc42と、Rab8、Rab10とRab13 3 4 5 6 7などのRasスーパーファミリーの低分子量GTPaseの配列によって調節されている。不活性なGDP結合状態とアクティブなGTP結合状態の間にあるすべてのGTPアーゼのようなこれらのタンパク質は、サイクル。ヌクレオチド結合領域に特異的な変異は、このサイクル8で干渉する。例えば、Rab13T22Nは恒久的に、GDP -フォームとこのように呼ばれる"ドミナントネガティブ"にロックされてRab13Q67LはもはやGTPを加水分解しないことができる一方、その結果、'支配的なアクティブな"状態7にロックされます。その機能を解析するために細胞内でGTPアーゼの両方ドミナントネガティブと支配的なアクティブな対立遺伝子は、通常は内因性タンパク質9の機能を妨害するために高レベルで発現されています。短時間で過剰発現の高いレベルを達成するためにエレガントな方法は、フィルタはマイクロインジェクション法を用いてサポートしている上に成長させた偏細胞の核に直接関連するタンパク質をコードするプラスミドを導入することである。これはしばしば、特に心尖部または側底部にソートされている細胞膜受容体をコードするレポータープラスミドの同時注入と組み合わされます。頻繁に側底部にソート貨物を分析するために使用される貨物は、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（VSVGts045）10の温度に敏感な対立遺伝子である。このタンパク質は39℃で正しく折り畳まれないことができると関心の調節タンパク質が細胞質ゾルで組み立てている間にこのように小胞体（ER）に保持されます。 31日までのシフト° Cその後VSVGts045は形質膜11にERや旅行を、適 ​​切に折り畳むままにすることができます。このチェイスは、一般的にクリーンな結果につながる、さらにタンパク質の合成を防ぐために、シクロヘキシミドの存在下で行われる。ここでは詳細に側底選別に関与する調節タンパク質の包括的な分析を可能にする温度変化を含む偏光セルとその後のインキュベーションにプラスミドをマイクロインジェクションの手順を説明します。

Protocol

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1。プラスミドDNAの単離

  1. 製造業者のプロトコルに従ってエンドトキシンフリーDNAを調製するためにシグマアルドリッチのエンドトキシンフリーmaxiprepキットを使用してください。それは確実にDNA調製物からのエンドトキシンを除去するので、このキットは、私たちのために動作します。細胞核にDNAを注入されているエンドトキシンは、細胞死につながる。
  2. 単離されたDNA、渦とエッペンドルフ微量遠心機で13,000 rpmで1分間スピンして100μlのフェノール/ chlorofom /イソアミルアルコール（25:24:1）を追加します。新しいチューブに、上部の水相を移し、100μlのクロロホルム/イソアミルアルコール（24:1）、上記のような渦とスピンを追加します。新しいチューブにDNAを含む上層の水相を転送します。このステップは、マイクロインジェクションの針の目詰まりを防止するDNA、から任意のタンパク質を除去するために必要です。
  3. 300mMの2 X体積の100％エタノールの最終濃度に酢酸ナトリウム（pH6.0）を添加することによりDNAを沈殿させる。一晩-20℃でインキュベートする。エッペンドルフ微量遠心機で13,000 rpmで20分間DNAをスピン、70％エタノールで1回洗浄し、300μlのエンドトキシンフリー水（Sigma - Aldrich社）で再懸濁します。
  4. DNA濃度を決定する。典型的なDNA濃度は1〜5μg/μLの範囲である。

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Discussion

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成功するマイクロインジェクションの実験のための最も重要なステップは、DNAや細胞の極性の品質と純度です。極性細胞がなければ、あなたの噴射制御が既にVSVGをmistargetedことになり、実験は使用できません。 DNAは低品質のものである場合、DNAは、貧しい人々やすべてにおいて所望のタンパク質の無発現を導く注射針を詰まらせることができる。また、そのようなpRKVなどの高い発現レベルを引き起こすことが知られている発現プラスミドを使用することをお勧めします。

あなたが他の貨物のタンパク質のソートをテストしたい場合は、温度シフトプロトコルを変更することができます。例えば、低密度リポタンパク質受容体を発現するために、我々は、37マイクロインジェクションを行う37℃で1時間のインキュベーションに続いてC ° C、20℃4時間℃（TGNで貨物を逮捕するために）、37で2時間· 0.1 mg / mlのシクロヘキシミドの存在下でCは、表面にタンパク質を追跡する。 20℃などのFc受容体などのタンパク質によって、インキュベーション時間のため° Cは、貨物のタンパク質が合成され、分泌経路を通過さ.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
利害の衝突は宣言されません。

Acknowledgements

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この作品は、H. Fölschへの健康（GM070736）の国立研究所からの助成金によって賄われていた。 SFアンリーは、A * STAR大学院奨学金の受賞によってサポートされていました、そしてRS姜氏は病の研修プログラムの細胞と分子基盤（GM8061）によってサポートされていました

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
試薬の名前 会社 カタログ番号
加熱された段階で200顕微鏡をAxiovert カールツァイス株式会社カスタムオーダー
Injectman NI2 Femtojetマイクロマニピュレーターエッペンドルフカスタムオーダー
Femtotips II（マイクロインジェクションの針） エッペンドルフ 930000043
Microloaderヒントエッペンドルフ 930001007
明確な12 mmのトランスウェルフィルターサポートコー​​ニングコースター 3460
エンドトキシンフリープラスミドmaxiprepキットシグマアルドリッチ NA0400

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mellman, I., Nelson, W. J. Nature reviews. 9 (11), 833-833 (2008).
  2. Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. Nature reviews. 6 (3), 233-233 (2005).
  3. Ang, A. L., Fölsch, H., Koivisto, U. M. The Journal of cell biology. 163 (2), 339-339 (2003).
  4. Kroschewski, R., Hall, A., Mellman, I. Nature cell biology. 1 (1), 8-8 (1999).
  5. Moskalenko, S., Henry, D. O., Rosse, C. Nature cell biology. 4 (1), 66-66 (2002).
  6. Schuck, S., Gerl, M. J., Ang, A. Traffic (Copenhagen, Denmark). 8 (1), 47-47 (2007).....

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Small GTPasesMicroinjection TechniquePolarized Epithelial CellsMDCK CellsPlasmid OverexpressionTemperature Shift AssayCycloheximide TreatmentConfocal MicroscopyBasolateral SortingVSVG Reporter

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