方法論記事

β-グルクロニダーゼ（GUS）に基づく細胞死アッセイ

DOI：

10.3791/2680

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2011年5月6日

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1Department of Plant Pathology and Microbiology, Institute for Plant Genomics and Biotechnology, Texas A&M University

この記事について

サマリー

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一般的にこのようなDNAラダーやTUNELアッセイのような哺乳類のシステムで使用されるプログラム細胞死のアッセイは、しばしば植物に再現することは困難です。 GUSレポーターシステムと組み合わせることで、我々は特定の遺伝子の潜在的な死の特性を解析するために迅速、植物ベースのトランジェントアッセイを提案する。

要約

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我々は、同時に細胞死の推定正または負の調節で、レポーター遺伝子、β-グルクロニダーゼ（GUS）を発現する新規の一時的な植物発現システムを開発した。このシステムでは、N. benthamianaの葉を分析する遺伝子を含む35S駆動発現カセットと同じ場所に浸潤、およびGUSベクターpCAMBIA 2301車両としてアグロバクテリウム株LBA4404を使用しています。生きている細胞が発生するGUSの発現に必要とされているため、このマーカー遺伝子は、細胞死の正の調節因子と共発現されると、GUS活性の損失が予想されます。同様に、GUS活性は、抗アポトーシス遺伝子をベクターコントロールと比較して使用する場合に観察される増加した。以下に示すように、我々が正常にプロと抗死のプレーヤーの両方を分析するために私たちのラボでこの制度を利用しています。これらは、植物の抗アポトーシスBcl - 2の関連athanoGene（BAG）家族だけでなく、そのようなBAXのような細胞死の既知の哺乳類の誘導を、含まれています。さらに、我々はこれらのタンパク質の可能な翻訳後修飾/アクティベーションについての手がかりを提供することができるタンパク質内の特定の切り捨て、の死の機能を解析するためにこの制度を利用しています。ここで、我々は、特定の遺伝子の死の機能を検討する上で最初のステップとして、迅速かつ高感度の植物ベースの手法を提案する。

プロトコル

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タバコbenthamiana植物は25℃での温度制御成長チャンバーで栽培されています。 3月6日週令の植物の完全に展開された健康な葉が使用されます。

ヒント：より良い結果が新たに出現した葉を使用して得られる

1。アグロバクテリウム一時的な浸透のプロトコル：

日1

  1. 細胞死のために、アッセイする遺伝子（群）とを含むベクターを用いて適切なベクターを含むアグロバクテリウムツメファシエンス（LBA4404株）のグリセロールストックを持つストリークLB /リファンピシン（25μg/ mlの）/カナマイシン（100μg/ ml）を寒天プレート構成的プロモーターの下でGUSカセット。常にネガティブコントロールとして空のベクターコントロールが含まれています。
  2. 28℃で2日間インキュベートする。

日3

  1. 以前に縞各LB /リファンピシン/カナマイシンプレートから単一コロニーとリファンピシン（25μg/ mlの）とカナマイシン（100μg/ ml）を含むLB 2 mlを接種する。
  2. 最大成長の密度に達するまで、200rpmで24時間28℃で振盪することにより、各培養液を、。

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ディスカッション

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これは、哺乳類のシステムでは一般的な植物で細胞死の検出技術を使用することは困難です。 GUSレポーターシステムと組み合わせることで、我々は細胞死のプレイヤーの検出と解析のための植物ベースの、敏感な手法を提案する。このメソッドは、生きている細胞が発生するGUSの発現に必要であるという単純な事実を利用しています。意味のある結果と再現性を確保するためには、GUSのカセットと、アッセイする遺伝子を保有する文化が等しい割合で浸透していることが重要です。追加の潜在的な細胞死のプレーヤーを比較するときにこれらの比率は維持されるべきである。上記のように、我々が正常に多くの遺伝子の潜在的な死の機能を調査するために私たちのラボでこのメソッドを使用している。そのシンプルさで、我々はこのシステムを日常的に死の変調を検出するために使用することができると信じています。さらに、メソッドは単一の文化の混合物に複数の遺伝子を収容するために調整することができます。時々あることですが、特定の遺伝子の細胞死の機能は、他のプログラム細胞死のエフェクターでその活性化/抑制によって左右されます。したがって、複数の遺伝子がこれらの可能性を調査するためにGUSカセットを持つ単一の.......

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開示事項

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利害の衝突は宣言されません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬の名前会社カタログ番号コメント（省略可能）
リファンピシン VWR IC19549001 DMSOに25mg/mLの株式
4' -ヒドロキシ-3'、5' -ジメトキシ（アセトシリンゴン） VWR TCD2666 DMSOの0.981グラム/ mLの（1M株）
2 - （4 - モルホリノ）エタンスルホン酸一水和物（MES） VWR EM - 6110 浸透培地1 Lを作るための水の1.92グラム/ L
バクトトリプトンフィッシャー BP1421 - 2 LB培地1 Lを作るための水で10g / L
バクト酵母エキス VWR EM1.03753.0500 LB培地1 Lを作るための水に5グラム/ L
ナトリウム塩化 VWR EM - 7710 LB培地1 Lを作るための水で10g / L
ナトリウム一塩基性リン酸一水和物 VWR MK - 7868〜12 バッファNAPIの50mmの作るための水に2.5グラム/ L
リン酸ナトリウム、二塩基七水和物 VWR EMD - SX0715 - 1 バッファNAPIの50mmの作るための水に5グラム/ L
硫酸マグネシウム七水和物 VWR EM - MX0070 - 1 浸透培地1 Lを作るための水では2.5 g / Lの
N -ラウロイルサルコシン VWR TCL0151 - 500G GUS緩衝液で0.1％v / vの
5 - ブロモ-4 - クロロ-3 - インドキシル-β- D -グルクロニドシクロヘキシル塩（X - gluc） ゴールドのバイオテクノロジー G1281C メタノール100％の1mg/100uL
4 - メチルウンベリフェリル-μ- D -グルクロニド水和物（MUG） シグマ M5664 GUS抽出バッファー100μlの2 mMの
フェロシアン化カリウム三水和物 VWR EM - PX1460 - 1 X - glucの基質溶液のための100mMの株式
β-メチルウンベリフェロン（MU） シグマアルドリッチ M1381 MU検量線の使用GUS抽出バッファー用
ナトリウム炭酸 VWR EM - SX0395 - 11 GUSストップバッファを作るための水に0.2 M

参考文献

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  1. Jefferson, R. A. GUS fusions: , β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3901 (1987).
  2. Nishihara, M.

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GUSNicotiana benthamiana35SGUS

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