3D楕円体の生成のための簡単​​なハンギングドロップ細胞培養プロトコル

1。単一の細胞懸濁液の調製

1. 接着細胞の培養は90％のコンフルエンスまで増殖されるべきである、whereupon単層をPBSで2回リンスする必要があります。よく排水後、0.05％トリプシン- 1mMのEDTAの2 MLSを（100 mmプレートの場合）追加し、37℃での細胞がデタッチされるまで。完全培地の2 MLSを追加することにより、トリプシン処理を停止し、静かに、細胞が懸濁液になるまで混合物を砕いて粉にするために5 mlのピ​​ペットを使用してください。 15 mlコニカルチューブに細胞を移す。
2. 室温で5分間に10 mg / mlのDNase株式とインキュベートの40μlを添加する。 5分間200 xgで軽くボルテックスして、遠心。
3. 上清を捨て、1mlの完全な組織培養の培地でペレットを洗浄。繰り返しますが、その後、完全な組織培養培地の2 MLSで細胞を懸濁します。
4. 血球計算盤、または自動細胞計数装置を用いて細胞をカウントし、2.5 × 10 ⁶細胞/ mlに濃度を調整する。このデモではBioRad社TC10自動細胞計数装置を用いた。

2。ハンギングドロップの形成。

1. 60 mmの組織培養皿と皿の底の場所のPBS 5mlのをから蓋を外します。これは、水和室として機能します。
2. 蓋を逆さにして蓋の底部上に10μlの滴を堆積させるために20μlのピペッターを使用してください。触れないでするように十分離れてドロップが配置されていることを確認してください。皿ごとに少なくとも20滴を配置することが可能です。
3. 37 PBS -満ちボトムチャンバーとインキュベート℃/ 5％CO ₂ /湿度95％の上にふたを反転させる、毎日の低下を監視し、細胞シートまたは凝集体のいずれかが形成するまでインキュベートする。ステレオ顕微鏡は、凝集体形成を評価するために使用することができます。
4. 一度シートの形、それらが回転楕円体の形になるまで℃、5％CO _2を完全培地の3のMLSを含む丸底ガラスシェーカーフラスコに移し、37で振とう水浴中でインキュベートすることができます。

3。ノート

1. セルのサイズに応じて、濃度が上下調整する必要があります。
2. 細胞は、膜はハンギングドロップ形成する前に蛍光色素を吸蔵で染色することができます。
3. 二つの異なる細胞型を差動でぶら下がっ滴の形成前に1:1（またはその他）の割合で染色し、混在させることができます。これらは遺伝的に特定の接着剤の署名を持つように設計癌と間質細胞、胚組織、または細胞であり得る。
4. 細胞は、カドヘリンの機能を維持するために0.05％トリプシン/ 2 mMのカルシウムを使用して組織培養皿から剥離することができます。
5. 実験によっては、用紙サイズはいずれかで測定することができる、または集計は機械的な試験や生化学的または分子解析のために使用することができます。

4。代表的な結果：

シートまたは回転楕円体の形成は、通常24時間以内に起こるが、細胞の種類に応じて時間がかかることがあります。図1は、未治療前立腺癌MAT - LyLu（MLL）ドロップ文化を吊り下げ中の細胞（図1A）または25μmのMEK阻害剤PD98059で処理した細胞のインキュベーションの18時間後に撮影した画像を表します。細胞シートの著しい圧縮におけるそのMEKiの治療の結果に注意してください。圧縮は10-20のサイズ（またはそれ以上）滴を吊り下げ、治療群間の平均サイズを比較して測定することによって定量することができます。我々はピクセル単位で画像全体の面積を明らかにするために、粒子の分析を適用するとすぐに我々は一般的に、バイナリモードに画像を、各画像を閾値変換することにより、ImageJのソフトウェアを使用して画像を分析する。これは、その後、簡単に平方ミクロンに変換することができます。図2は、未処理とMEKi処理MLL細胞のサイズの比較を表しています。スチューデントt -検定（P <0.0001）で比較して、前述したように、MEKiの治療は大幅にシートサイズを減らします。この比較のために、未処理及び処理した細胞の各10凝集体を測定した。図3は、ドロップの文化をぶら下げで24時間とシェーカーバスで2日後に形成されたニワトリ胚肝臓の回転楕円体を表しています。

ハンギングドロップアッセイはまた、採択された空間的位置を明らかにするために複数の細胞型を含むように変更することができます。例えば、ニワトリ胚の肝細胞は、蛍光膜 - インターカレート色素で染色し、別の蛍光マーカーで染色されているニワトリ胚心臓の細胞と混合した、単離することができる。混在したままになることではなく、図4Aに示すように、肝臓や心臓の細胞は一から別の"アウト並べ替え"と心臓の細胞が肝細胞に包まれている球の内、球の構成を採用する傾向がある。この設定は、肝臓と心臓の細胞間の細胞間接着の違いによって説明できる。この概念は、膵島細胞の組織⁵用とi同一の2つの細胞集団の間で細胞選別のため、両生類の³と硬骨魚類⁴胚の胚性生殖層の組織との間の細胞ソートの動作を説明するために使用されている差動接着仮説に成文化されNカドヘリン^（6および図4B）の同じ種類の発現レベル以外のすべての点。この結果は、細胞集団の間の接着の単純な違いをエンジニアリング方法を実演するために特に重要なのは、例えば、臓器の構造の発生につながる可能性、膵島^5。

図1のどちらかが存在しない（A）または存在下で18時間点滴培養をぶら下げでインキュベートした細胞の画像（B）のMEK阻害剤PD98059の25μmの。画像は、ニコンのEclipse TE 300落射蛍光顕微鏡とPhotometrics CoolSnap ESデジタルカメラを使用して捕獲された。

図2。ラット前立腺癌MLL細胞のMEKi誘発性圧縮の定量。上記のような凝集体サイズを決定したとすぐに未処理とMEKi処理MLL細胞のハンギングドロップ培養を18時間インキュベートした。凝集体サイズの統計的分析はスチューデントt検定によって行った。アスタリスクは、未処理とMEKi処理細胞間の集約サイズで統計学的有意差（P <0.0001）を表し、その有意に小さく、よりコンパクトな集合体でMEKi処理の結果を示唆している。

図3。インキュベーターにして18時間点滴培養を吊り下げ/ 48時間風呂を振りにニワトリ胚肝細胞をインキュベートすることによって形成された回転楕円体。この画像は、Nikon SMZ800ステレオ顕微鏡とソニーブラックCCDカメラを用いて捕獲された。

図4。ドロップの文化を吊るすには、異なる種類の細胞の間にソートアウト挙動を明らかにする。パネルでは、ニワトリ胚の肝細胞がPKH - 2膜インターカレート色素で染色し、PKH - 26ステンドニワトリ胚心臓の細胞と同じ割合で混合。パネルBでは、二つのN -カドヘリン-トランスフェクトL細胞クローン（LN4とLN2a）、2.4:1の比率で、その表面でのN - CADを表現するには、また、蛍光膜インターカレート色素PKH - 2、PKH - 26で染色した、（Sigma - Aldrich）を、等しい割合で混合し、滴^7を吊り下げて培養した。文化の中で18時間後、細胞シートは、振盪フラスコに移し、さらに48時間インキュベートした。集計がに2％パラホルムアルデヒドで固定したリン酸緩衝生理食塩水とニコンオプチフォト- 2顕微鏡に接続されているバイオラッドMRC600走査型レーザー共焦点顕微鏡システムで表示。緑と赤の両方のチャンネルからの光学切片を採取したとVital Imagesはボクセルビューウルトラのイメージングソフトウェアを搭載したシリコングラフィックスクリムゾンVGXのワークステーションは、両方のチャンネルに偽色を割り当てることや画像をマージするために、生成された解剖学的構成を明らかに使用されていました。（）擬似カラー青の肝細胞^（8から）で心臓の細胞（ここで疑似カラーの黄色の）の包囲を示す集約を通じて、共焦点光学セクション。 N -カドヘリン（赤^）（6）の低レベルを発現することにより、高N -カドヘリンを発現する細胞（緑色）の集合体を実証包囲から（B）共焦点光学部。