シンプルなスロットブロット法は、バイオインフォマティクス解析によって同定された彼らの最も保存された配列を標的とする普遍的な抗体を用いてインフルエンザウイルスのヘマグルチニンとノイラミニダーゼの定量化のために開発されました。この革新的なアプローチは、すべてのウイルスのヘマグルチニンとノイラミニダーゼの定量に有用な代替手段を提供することがあります。
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方法論記事
すべてのインフルエンザA型の定量的な分析シンプルなスロットブロットアッセイでユニバーサル抗体を用いたウイルスHemagglutininsとノイラミニダーゼ
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サマリー
要約
ヘマグルチニン（HA）とノイラミニダーゼ（NA）はウイルスのライフサイクルと防御免疫反応の1,2の誘導に重要な役割を果たすことが知られているインフルエンザウイルスの2つの表面蛋白質である。中和抗体の主要なターゲットとして、HAは現在、インフルエンザワクチンの効力のマーカーとして使用され、一元放射免疫拡散（SRID）3によって測定されます。しかし、対応するサブタイプ特異的抗血清の可用性にSRIDの依存性はすべての新しいワクチンのリリースのための2-3ヶ月の遅延の最小値になります。また、NAにも防御免疫4を誘発するという証拠にもかかわらず、インフルエンザワクチンのNAの量がまだのために適切な試薬や分析法5の欠如に標準化されていません。このように、HAとNA抗原を定量することができるシンプルな代替方法は、Rapid Releaseとインフルエンザワクチンのよりよい品質管理のための望ましいです。
すべての利用可能なインフルエンザのHAとNAの配列における普遍的に保存された領域は、6月7日バイオインフォマティクス解析により同定した。つの保存配列はノイラミニダーゼ、一酵素活性部位に近い（HCA - 2として指定）とで識別されたうちの一方のシーケンスは、（ユニ- 1として指定）、HA、融合ペプチド6の唯一の普遍的に保存さエピトープが同定されたN -末端に他の近くに（HCA - 3として指定）7。これらのアミノ酸配列を有するペプチドを合成し、抗体の産生のためにウサギを免疫するために使用された。 HAのユニ- 1エピトープに対する抗体は、HCA - 2とNAのHCA - 3の領域に対する抗体は、全9 NA亜型を結合することが可能であった間にインフルエンザHA（H1 - H13）の13サブタイプに結合することができた。尿膜タンパク質との交差反応性が検出されなかったことを観察によって証明されるようにすべての抗体は、ウイルス配列に対して顕著な特異性を示した。これらの普遍的な抗体は、特異的抗血清7,8がなくてもインフルエンザワクチンのHAとNAを定量化するためにスロットブロットアッセイを開発するために使用されていました。ワクチンのサンプルは、種々の濃度に希釈した標準品と一緒にスロットブロット装置を用いてPVDF膜に適用した。 HAの検出のために、サンプルと標準は、最初に希釈したトリス緩衝NAの測定のために彼らはこれらの条件としてZwittergent 0.01％を含むTBSで希釈しながら、4M尿素を含有する生理食塩水（TBS）が有意に検出感度を向上した。それぞれの普遍的な抗体でイムノブロットすることによって、HAとNAの抗原の検出に続いて、信号強度はデンシトメトリーにより定量した。ワクチンのHAとNAの量は、使用される参照の種々の濃度の信号強度と確立された標準曲線を用いて計算した。
これらの抗体は、HAまたはNAのユニバーサルエピトープに結合することを考えると、関心のある研究者は、スロットブロット以外のイムノアッセイで研究ツールとしてそれらを使用することができます。
プロトコル
1。試薬と機器の準備
- スロットブロットの手順を開始する前に、トリス緩衝生理食塩水（20 mMトリス、137 mMのNaCl、pH7.6）で（TBS）0.01％の赤血球凝集素、またはHA、スロットブロット、または20_mlsためには、Zwittergentで4M尿素溶液の20_mlsを準備ノイラミニダーゼのためのTBS、またはNA、スロットブロットのソリューション。 4M尿素、毎回新鮮に準備されるべきである一方、のdH 2 Oで10％Zwittergentストック溶液は、室温で少なくとも6ヶ月間安定であり、したがって、各アッセイ前にTBSで0.01％に希釈することができる。
- 最終濃度0.1％にTBS溶液にTween - 20を追加することにより、洗浄バッファーの2000 MLSを準備します。洗浄バッファーで5％w / vの中の最終濃度に脱脂粉乳を（グレード脱脂粉乳をブロッティング）溶解することによりブロッキングバッファー80 MLSを準備します。
- のddH 2 Oですすぎ2分に続いて15秒のためのメタノールでPVDF膜（9 × 12 cmの大きさにあらかじめカットして）、アクティブに使用するまでTBSで膜を浸す。 TBSのバイオドットSFろ紙のプレウェット3枚使用するまで。
2。 HAスロットブロット用のインフルエンザワクチンのサンプルとリファレンススタンダードの調製<....
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ディスカッション
これら2つの表面のタンパク質が免疫応答の6-11を誘発する最も重要なウイルス成分なので、インフルエンザウイルスのHAとNAの定量は、ワクチンの研究開発にとって重要です。これらのタンパク質の検出のための以前に報告された免疫学的方法は、歪みの特定の抗体が必要です。抗体は彼らの唯一の普遍的に保存されたエピトープ6-8を認識するので、HAとNAの抗原ここで説明を定量化するために、簡単な再現性と迅速なスロットブロット法は、すべてのインフルエンザウイルスのHAとNA蛋白質に適しています。この方法に興味がある研究者のための唯一の難しさは、彼らが社内ではそのような普遍的な抗体を持っていないことかもしれません。しかし、抗原としてペプチドを使用して、これらの抗体の生成は、日常的な手順です。亜種のペプチドは、競合ELISA 6-8の特定のペプチドに結合するために自分たちの中でも同様に競合するので、関心のある科学者が記載された手順に従って抗体自体を作ることができる一方で、彼らはまた、ように、HAとNAの抗体の作者にコンタクトをとることが彼らの探索研究に使用。
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開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
著者は、原稿の編集審査のために夫人モニカTocchiに感謝したいと思います。 AMHは、カナダにおけるサウジアラビアの文化局を通じて、キングアブドゥルアジーズ大学からの奨学金によってサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬や機器の名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| バイオドットSFの精密ろ過装置 | Bio - Rad社 | 170-6542 | |
| バイオドットSFフィルターペーパー | Bio - Rad社 | 162-0161 | |
| イモビロン- FLトランスファーメンブレン（PVDF） | ミリポア | IPFL00010 | |
| 真空ポンプ | ミリポア | WP6111560 | |
| 化学発光Biomaxのライトフィルム | コダック | 178 8207 | |
| FluorChemゲルドキュメンテーションシステム | アルファイノテック | 29から008 - 1896X | |
| HAとNAの抗原に対する普遍的なウサギ抗体 | UNI - 1（HA）HCA - 2、HCA - 3（NA） | 抗体は、MTAを介して入手するか、以前に6,7を説明した手順にしたがって興味のある研究者によって生成することができます。 | |
| インフルエンザワクチンの基準抗原 | CBER / FDAまたはNIBSC | ||
| インフルエンザワクチンのサンプル | ほとんどの国で一般的に使用可能 | ||
| 尿素 | シグマアルドリッチ | U1250 | |
| Zwittergent 3月14日洗剤 | カルビオケム | 693017 | |
| Tween - 20を | フィッシャーサイエンティフィック | BP337 - 500 | |
| ブロッティンググレードブロッカー脱脂粉乳 | Bio - Rad社 | 170-6404 | |
| ImmunoPureヤギ抗ウサギIgG（H + L）、共役ペルオキシダーゼ | サーモサイエンティフィック | 31460 | |
| SuperSignalウエストデュラエース拡張期間の基板 | サーモサイエンティフィック | 34075 |
参考文献
- Webster, R. G., Bean, W. J. Genetics of influenza virus. Annu Rev Genet. 12, 415-431 (1978).
- Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annu Rev Biochem. 69, 531-569 (2000).
- Wood, J. M.
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再版と許可
訂正
Formal Correction: Erratum: Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays
Posted by JoVE Editors on 11/13/2012. Citeable Link.
An author's affiliation was omitted from the publication of Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays.
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