Method Article

特定のヒトと動物のウイルスを用いた微生物ソースのトラッキングのための費用対効果の高い方法

DOI:

10.3791/2820

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December 3rd, 2011

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1Laboratory of Water and Food Viral Pollution, Department of Microbiology, Faculty of Biology, University of Barcelona

In This Article

Summary

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研究では、MSTのツールと​​して提案したヒト/ブタ/ウシDNAウイルス、アデノウイルスとpolyomaviruses、特定の定量化のために定量PCRを用いて水中の硝酸塩による尿/糞便汚染または汚染源の同定のための費用対効果の高い方法を説明します。

Abstract

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環境の微生物汚染は重大な健康上のリスクを表しています。古典的な細菌の糞便指標が重要な限界があることが示されている、ウイルスが汚染源に通知していない多くの不活性化プロセスと標準の糞便の指標に対してより耐性があります。費用対効果の高い水からのウイルスの濃度のための方法と分子アッセイの開発は、糞便汚染の指標として、微生物源の追跡（MST）ツールとしてウイルスの適用を容易にします。アデノウイルスとpolyomavirusesは、ヒトを含む特定の脊椎動物に感染するDNAウイルスであり、永続的に糞及び/または調査したすべての地理的領域における尿中に排泄される。以前の研究では、我々は人間の糞便汚染の指標として定量PCR（qPCR）により、ヒトアデノウイルスの定量化（HAdV）とJCのpolyomaviruses（JCPyV）を提案した。最近、我々は、PORの特定の定量化のためのqPCRアッセイを開発しました。試験管当たり1〜10ゲノムコピーの感度と汚染の動物糞便のマーカーとしてシネアデノウイルス（PAdV）とウシpolyomaviruses（BPyV）。本研究では、我々はこれらのツールを使用して水試料中の汚染源を特定するために従うべき手順を示します。代表的な成果の例として、硝酸塩の高いレベルを提示する地下水のウイルスの分析が示されています。

低または中程度に汚染された水域でのウイルスの検出は、はるかに少ない量に水の少なくとも数リットルからのウイルスの濃度、通常は直列の2つの濃度のステップが含まれている手順が必要です。この少々面倒な手順やウイルスの回収率で観察された変動は大幅に水の多数のサンプルの同時処理を妨げる。

我々は以前のstudieで開発したワンステップのプロトコルを適用した二段階の手続きによって生じるボトルネックを解消するためにsと水マトリックスの多様性に適用される。十リットルの水試料の酸性化、スキムミルクで凝集、凝集物質の重力沈降、沈殿と遠心分離のコレクション、10 mlのリン酸緩衝液中の沈殿物の再懸濁を：手順が含まれています。ウイルス濃縮液は、ウイルス核酸の抽出に使用され、関心のある特定のアデノウイルスとpolyomavirusesは、定量PCRにより定量化されています。サンプル数が多いが、同時にこの低コストの濃縮法を用いて解析することができます。

手順は、入浴の海、海水や河川水の分析に適用し、本研究では、我々は、地下水のサンプルを分析結果を提示されています。このハイスループット定量法は、信頼性の高い簡単な、そして費用対効果の高いです。

Protocol

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1。水試料中に存在するウイルス粒子の濃度

  1. 水試料の収集とコンディショニング
    1. 2の最小値を収集するプロセス制御などの平らな底部及びつの余分なサンプルをプラスチック容器内の試料あたり10 Lの複製。この最後のサンプルは、ウイルス粒子の既知量をスパイクし、コントロールとして使用されます。
      注：これは、添加サンプルのための特別な別の材料を（瓶、チューブ、など）を使用することが推奨されます。
    2. conductimeterのキャリブレーションを確認し、必要に応じて再キャリブレーション。つの余分なプラスチック製の10リットルの容器で、以前に十分な導電率に調整した水道水を（1.6下記参照）を使用してネガティブコントロールを用意します。
    3. 添加サンプルの場合：サンプルにコントロールウイルスの標準量（水10Lあたり約10 5ゲノムコピー）を追加します。回避飛散やエアロゾルを攪拌して混ぜる。ポジティブコントロールは、アデノウイルスsの珍しい株で構成されています可能性がHAdV - 35またはMS2のようなバクテリオファージとしてUCH。
    4. サンプルは、浮遊物質（砂または他の材料）の高い量を提示した場合、15分間堆積物にしましょう​​。新しい容器に水を移す。
    5. 1 N HClの添加によって3.5（± 0.1）に水試料のpHを調整します。このステップでは、ウイルスの濃度が重要であるので、pHを適切に調整されていることを確認し....

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Discussion

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再現性、信頼性の高い、簡単で、費用対効果：説明する手順では、ルーチン、環境および公衆衛生研究所のためのフィッティング方法のための条件を満たすでしょう。プロトコルはシンプルですが、それは注意深く従ってください。凝集のための攪拌時間を大幅に（たとえば5時間未満）減少する場合のように人工海水の塩の要求された濃度を加えることなく、試料中の低導電率が飛躍的にウイルスの回収を減らすことができます。

現在適用されているMSTのツールは、一般的に分子生物学的手法に基づいています。異なるグループによって開発された研究では、必要に応じて、現在使用されているパラメータのうち5.0（すなわち細菌の遺伝子が）どれものような特定がないことが示されている。したがって、これらのパラメータの組み合わせの使用は、水域8,11の糞便汚染の起源を効率的に追跡するための最良の近似値として提案されている。

近年jove_content">、多くの場合、臨床症状がない場合の永続的な感染症を生成する選択したDNAウイルスの研究は、環境でソースの追跡糞便汚染のための方法とし.......

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Disclosures

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二つの特許出願は、PAdVとBPyVの定量化のためのプロトコルの知的財産を保護するために2009年に提起された。

Acknowledgements

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この研究の一部は、欧州連合（EU）の研究枠組み7資金プロジェクトは、（契約番号513648）VIROBATHE、VIROCLIME（契約番号は243923で、スペイン政府は"保健省ドEducación Y Ciencia"（プロジェクトAGL2008-05275-C01/ALI）によってサポートされていました）と水のカタロニア庁、AgènciaカタラーナドゥAigua（ACA）、Departamentド制御I Millora DELS Ecosistemes水泳で。開発研究の間マルタルシニョールはカタロニア政府"AGAUR"（FI - DGR）の仲間だった。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
試薬の名前 会社 カタログ番号 コメント
高速遠心（8,000 × g）でバークマンコールターアヴァンティJ - 20XP
pHメーター、温度計とconductimeter Afora LPPC3003
プラスチック製のチューブ100〜200センチメートルの長さ Deltalab 350059
滅菌は、使い捨てピペットを卒業 Labclinics PN10E1
1.5 10〜15 mLの滅菌プラスチックチューブ（エッペンドルフ、ファルコンズ、等） Afora KA298/00
ポットを遠心（500mL中） フィッシャーサイエンティフィック SE5753512
磁気撹拌器と磁石（ごとにサンプル） フィッシャーサイエンティフィック 10510
マグネットスターラーの使用を許可するように平らな底を有するガラスまたはプラスチック製の容器 Deltalab 191642
上清を除去するための蠕動ポンプ（またはウォータージェット真空ポンプ） ワトソン - マーロウ 323E / D
8-10時間後に攪拌をオフにするタイマー Deltalab 900400
塩酸（1Nと0.1N） Panreac 141020.1611
水酸化ナトリウム（1N） Panreac 131687.1211
人工海水の海塩シグマ S9883
スキムミルク（SM） ディフコ 232100
リン酸緩衝液のpHを75 pH7.5ので1:2 v / vの無菌のNa 2 HPO 4 0.2 MのとのNaH 2 PO 4 0,2 M
チオ硫酸 Panreac 121879.1209 水中の10％溶液を作る
ウイルスRNA Mini Kitを別途準備キアゲン 52904
96ウェル光学反応プレート（500台） アプライドバイオシステムズ 43426659
光学接着剤のカバー（100台） アプライドバイオシステムズ 4311971
のTaqMan環境PCRマスターミックス2倍アプライドバイオシステムズ 4396838

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Major, E. O., Curfman, B., Girones, R. Analysis of the excreted JC virus strains and their potential oral transmission. J. Neurovirol. 9 (4), 498-507 (2003).
  2. Bofill-Mas, S., Albinana-Gimenez, N., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Rodriguez-Manzano, J., Allard, A., Calvo, M., Girones, R.

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Microbial Source TrackingVirus ConcentrationSkimmed Milk FlocculationQuantitative PCRAdenovirus DetectionPolyomavirus QuantificationWater Sample AnalysisNucleic Acid ExtractionFecal Contamination MarkersHigh throughput Method

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