ウイルスベースのCre組換えによる出生後のマウスの脳の発達における遺伝子機能のモザイク解析

Summary

アン in vivoで方法が記載されている。 CREおよび/または蛍光タンパク質を発現する組換えAAVsは、新生児マウスの脳に注入されています。モザイク遺伝子の不活性化とスパース神経ラベリングは神経回路の発達に重要なプロセスで遺伝子機能の迅速な分析を可能にする、達成されています。

Abstract

神経回路が成熟し、洗練されているときに正常な脳の機能は、生後発達にだけでなく、主要な神経経路が確立されている胚発生に依存していますが、。この段階での制御ミスは、自閉症や統合失調症の^1,2などの神経および精神疾患につながる可能性があります。多くの遺伝子は出生前の脳で勉強し、多くの発達過程^3-5重要な発見されている。しかし、出生後の脳におけるそれらの機能は、マウスでそれらの欠失はしばしば新生児の開発中に致死性につながることもあり、あまり知られていない、と開発の初期段階でそれらの要件は、出生後の分析を阻害する一因。これらの障害を克服するために、これらの遺伝子のfloxed対立遺伝子は、現在マウス⁶で生成されています。するときは、特定の細胞型で発現するCreリコンビナーゼ、条件付きの削除は生後脳における遺伝子機能を研究するために達成することができることをトランスジェニック対立遺伝子と組み合わせる。しかし、この方法では、それによってマウスの脳内で大規模に遺伝子解析の拡大を制限し、追加の対立遺伝子と適切な遺伝子型を有するマウスを作製するために余分な時間（3〜6ヵ月）が必要です。

ここでは、生後脳の発達で急速にかつ体系的にこれらのfloxed対立遺伝子を研究するためにウイルスにより発現するCreを使用して補完的なアプローチを示しています。新生児の脳の中に組換えアデノ随伴ウイルス^{（rAAVs）7,8}エンコーディングCreを注入することにより、我々は脳の異なる領域に目的の遺伝子を削除することができます。ウイルス力価を制御し、蛍光タンパク質マーカーを共発現することにより、我々は同時にモザイクの遺伝子の不活性化とスパース神経ラベリングを実現することができます。このメソッドは、分岐、およびタイルだけでなく、シナプス形成と洗練された、開発の初期段階で多くの遺伝子の要件をバイパスし、私たちは軸索と樹状突起の成長を含む生後脳の発達の多くの重要なプロセスでそれらの細胞自律的な機能を、勉強することができます。このメソッドは、我々自身の研究室（未発表の結果）など^8,9で正常に使用されており、このようなレンチウイルス⁹など他のウイルス、、するだけでなく、shRNAまたは支配的に活性なタンパク質¹⁰の表現に拡張することができます。さらに、電気生理学でこのテクニックを組み合わせるだけでなく、最近開発した光イメージングツール¹¹で、この方法では、遺伝的経路はマウスとラットにおける神経回路の発達と機能にどのように影響するかを研究する新たな戦略を提供します。

Protocol

1。注射の準備ウィルス

1. rAAVsは推奨商用ベンダーから購入したが、彼らはまた、（下の説明を参照）自分の研究室で製造することができる。ウイルス溶液は、typicallyミリリットル当たり〜1 × 10 ¹²ゲノムコピー（GC / ml）の力価で産生され、多数のセルを操作する完全な力価で使用することができる。また、彼らは疎ラベリングの必要なレベルを生成するために希釈することができる。適切な希釈は、ユーザによって決定される必要がありますが、1:10希釈液を開始することをお勧めします。
2. 使用直前に氷の上でウイルスを解凍。小（〜250μlの）のPCRチューブにウイルス液を所望の予備希釈量を転送する。組織培養フードに滅菌DPBSの適切な量を使用してウイルス溶液を希釈する。それが必要になるまで氷上に希釈したウイルス溶液を保管してください。

注記：すべてのウイルスの処理は、あなたの機関によって承認されたバイオ安全議定書に従って実施されるべきである

2。注射器の負荷と機器の組立

1. 静かにプランジャーを引いて、ガラスの注射器に装填針を接続し、PCRチューブからウイルスソリューションを策定する。空気の非常に小さな気泡が注射器で見ることができるまで、プランジャーを引いて、これは、ソリューションのすべてが注射器になっているとローディング針に残されていないこ....

Discussion

ここで紹介する新生児のウイルスの注射法では、生後脳の発達の研究のための生体モザイクで生成するための簡単かつ迅速な方法を提供します。方法は、プロジェクト^6をターゲット^に高スループットの遺伝子を介して行われているものとしてだけでなく、現在利用可能なfloxed対立遺伝子を利用しています。のCreのトランスジェニック発現の使用に比べて、このメソッドはfloxed対立遺伝子を持つマウスを実験に直接使用することができるように、種々の細胞型における遺伝子機能をテストするための迅速な方法を提供し、より全体のウイルスの注入手順が完了するまで開始することができます時間の下で行うこと。さらに、感染した細胞の数を容易に個々のニューロンのまばらなラベリングを可能にするウイルスの力価を変えることによって制御することができます。我々は唯一のサンプル画像で神経形態を説明したが、感染した神経細胞の分析は、分岐やタイル、だけでなく、脊椎の形態形成、シナプス開発、軸索と樹状突起の成長を含む多くの重要な発生過程、に拡大することができます。

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント（省略可能）
rAAV8 - Creを、- GFP、- DsRedを、	ベクトルバイオラボ	＃7060、＃7061、カスタムオーダー	http://www.vectorbiolabs.com
ハーバードポンプ11プラス	ハーバード装置	＃702208	（なしフットペダルのポート）
網膜色素上皮インジェクションキット	世界の精密機器	RPE - KIT	結合チューブ、注射針（36G）、及びニードルホルダーが含まれています
NanoFilシリンジ、100μlの	世界の精密機器	NANOFIL - 100	再利用可能なローディング針を含んで
D - PBS	インビトロジェン	14040-117
GFP抗体	鳥綱	GFP - 1020
DsRedタンパク質抗体	クロンテック	632496
加熱ブロック	VWR	97042-610
ROSA26Rマ​​ウス	ジャクソン研究所	003309