手術標本の腫瘍外植片を用いて新規抗がん薬の開発のための方法

サマリー

ここで、我々は、"腫瘍外植法"と呼ばれる脳腫瘍の手術標本での薬効試験のための方法を確立した。この方法では、我々は、固形腫瘍の微小環境を壊すことなく、薬効を評価することができます。この方法の信頼性を検証するために、我々は、現在のファーストラインの化学療法剤による治療を受けた私たちの神経膠腫の標本とテモゾロミドの代表的なデータを記述する。

要約

悪性神経膠腫のための現在の治療は姑息的効果を持っている。治療法の開発のために、一つのハードルは、現在の薬効試​​験や患者への有効性によって決定される有効性の不一致です。したがって、薬効を評価するための新規かつ信頼性の高い方法は、前臨床段階では保証されています。細胞株を含む腫瘍組織のin vitro培養 、細胞培養の人工的な環境によって引き起こされる癌細胞の実質的な、表現型の遺伝、およびエピジェネティックな変化を持って、どのその場で元の腫瘍の生物学を反映しない場合があります。免疫不全マウスを用いた異種移植モデルも限界、すなわち、免疫システムの欠如があり、微小環境における遺伝的およびエピジェネティックな矛盾を種間。ここで、我々は、治療効果を評価するために解離していない腫瘍のブロックなどの悪性神経膠腫の手術標本を用いて新規な方法を示しています。この方法を検証するために、現在のファーストラインの化学療法剤、テモゾロミド（TMZ）、とのデータが記載されている。

我々は我々の実験のための悪性グリオーマの新たに除去された手術標本を用い。我々は手術標本でのインキュベーションおよび分析に続いて、TMZまたは他の医薬品候補の腫瘍内注入を行った。ここでは、我々は、少なくとも、現在いくつかの制限を克服し、現在の実験の間に、既存のギャップを埋めることができるかもしれないように、新規抗がん治療の有効性を決定するためのプラットフォームとして腫瘍組織の外植片の方法を確立しようとしたデータと実際の患者の腫瘍に対する有効性。このメソッドは、固形がんの治療のための新規化学療法剤を同定する加速する可能性があるかもしれません。

プロトコル

1。メディアの準備

1. （1.01614.1000 - EMD粒状、0.6％寒天溶液を精製 - 液体1:1（Invitrogen社製10565から042）、DMEM/F-12（1X）に - メディアは、10％FBSを（GIBCO 16140から071）を用いて調製した）。滅菌条件は、実験を通して維持された。
2. FBSのメディア5mLの（16140から071 - GIBCO）の準備のために - 50mLに対しての最終的なボリュームを作るDMEM/F-12（1X）の45mL、液体1:1（Invitrogen社製10565から042）に登録されました。準備メディアを37 ° Cの温度の水浴中で保たれた。
3. 寒天溶液は、熱波法を用いて調製した。 0.3グラムグラニュー寒天は、マイクロ波を用いて50mLの蒸留水に溶解した。寒天液は水浴にそれを維持することによって37℃の温度までクールだった。
4. 我々は、ステップ1.2および1.3と準備ストック溶液からのメディアの等量を使用。 0.6％寒天（0.5mLを）および10％FBS-D-MEM/F-12メディア（0.5mLを）の比率は6ウェルプレートの各ウェルに1mLずつの合計量を作る、1:1であった。

2。組織の処理

1. 神経膠芽腫多形（GBM）の組織は直ちに病理部から手術後に受信された。組織は、病理部からGBMに分類された。
2. 組織は、3回のために慎重に、氷冷5mLの1XPBSで洗浄鉗子を使用して、父プレートに移した。
3. 標本の連続切片は、手術のブレード（羽根- 2976＃10）とforcep（フィッシャーサイエンティフィック）と腫瘍のブロック（直径約10 mm）を作成するために解剖試料から切り出した。
4. ブロックは、6ウェルプレートに移した。メディアの各ウェルを含むれた1mLのは、ステップ1.4で言及。組織は、組織が実行可能で維持するために空気に十分な露出を持っていた。
5. 腫瘍のブロックが次にDMSO（5％）またはTMZ（2.5 nM）のどちらかを注射し、37℃で16時間インキュベートした℃、5％CO2を含む加湿空気インチDMSOの0.1mlを（5％）またはTMZは、一貫性のある治療のためのさまざまな場所での腫瘍のブロックに3回注射した。薬剤は、28G1 / 2 0.37X12.7mmインスリンシリンジ1mLの（コンフォートポイント- 26027）を用いて注入した。
6. 16時間後のブロックは3回、5 mLの1XPBSで洗浄した。ブロックを洗浄した後、50mLのチューブ（Basix - 5539802）で24時間V / V、10％ホルマリン10mlの（リッカ化学会社）で固定し、4μmのセクションをパラフィン包埋のために処理。
7. ホルマリン固定されたセクションは、"NO HEAT"で撹拌プレート上ビーカーに入れ、各溶液中で30分間、次のソリューションを介して処理されました。 30％エタノール、50％エタノール、75％エタノール、80％エタノール、95％エタノール、100％エタノール、キシレン。
8. 組織は、ペーパータオルにブロットし、30分間溶融パラフィン（58〜60℃、フィッシャーParaplastのパラフィン）に置かれた。
9. 組織がSurgipathブルーリボンのパラフィンを使用して金型に埋め込まれ、埋め込まれた組織を室温まで冷却した。
10. パラフィン包埋4μm組織切片を採取し、フィッシャープラスのスライド上に置いた。

3。免疫組織化学

前述のように免疫組織化学を行った^。1

1. 脱パラフィンし、水分補給は、ラックにスライドを配置し、次の手順を実行します。 3X5分（5分間3回）、3X5分間100％エタノール、1 × 5分間、95％エタノール、1 × 5分間、70％エタノールキシレンは、3分間水道水を流しで洗う。
2. ガラスビーカーに蒸留水で希釈した1 ×クエン酸緩衝液（サーモ科学- AP9003 - 500）の熱誘導エピトープ検索浸漬のスライドと抗原の検索。ホットプレート（必ずセクションドン"tはスライドを落下させる）上で15分間煮る。室温で30分間冷却ソリューションは、。3X5分間1X PBSでスライドを洗浄します。
3. 内部過酸化の阻害は、15分間のガラスビーカーに0.3％過酸化水素（フィッシャーサイエンティフィック- BP2633 - 500 -希釈蒸留水で）とメタノールのスライド（フィッシャーサイエンティフィック- 452 - 4）を浸します。 3X5分間1X PBSでリンス。
4. ブロッキングは10％正常ヤギ血清と組織をカバー。湿度の高いボックスにスライドを移し、室温で1時間インキュベートします。 3X5分間1X PBSでスライドを洗浄します。
5. ヒト特異的カスパーゼ3（1:1,000、R＆Dシステム、AF835）、Ki67は（1:1、Dako社、15626）1X PBSで希釈した：一次抗体のセクションは、° C一次抗体と、以下の濃度で4℃で一晩インキュベートした。翌日の1X PBS 3 × 10分でスライドを洗浄します。
6. 二次抗体反応は、HRP標識二次抗体の2〜3滴（思い描くシステム）との組織をカバー。湿度の高いボックスでスライドを入れ、室温で1時間インキュベートします。 3 × 10分間1X PBSで洗浄する。
7. 検出は、製造元のプロトコールに従って、一次抗体の検出のための発色DABキット（ベクターラボラトリーズ- SK - 4100）のために開発。
8. 対比染色はヘマトキシリン​​（10-15秒でスライドを浸し econdsは、）必ずドン"TランDAB信号を作る。3分間水道流水ですすぎます。
9. 脱水浸し、次の順序でスライド、3X5分間キシレン5分、5分間95％エタノール、3X5分間100％エタノール、70％エタノール。
10. permountマウンティング試薬（フィッシャーサイエンティフィック- SP - 15 - 100）を使用してスライドをスリップカバー。
11. 画像は、オリンパス蛍光顕微鏡（DP - 72）.3.11）を使用して撮影した。すべての実験では、特定のラベルは、一次抗体なしのネガティブコントロールにより確認された。

4。代表的な結果：

我々は、多形性膠芽腫（GBM）の手術標本を集めた。患者がテモゾロミド（TMZ）を含む従来の化学療法なしで最初の手術を受けた。図- 1aのガドリニウム増強MRIのT1強調画像は、手術前に右前頭葉に強化された腫瘍を示した。術後の画像（図- 1b）は手術後の病変の小計除去を確認した。外科的組織は、臨床診断の目的のために病理部に送られ、そして残りの標本は、オハイオ州立大学メディカルセンターで承認された治験審査委員会（IRB）プロトコルの下で組織の調達に処理されました。ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）染色では、壊死の存在、pseudopallisading細胞、および微小血管増殖（図1 - c）を示した。従って、これらの腫瘍は病理組織学的にGBMと診断された。注目すべきは、48時間までTMZなくインキュベーションを以下の腫瘍外植片は、GBMの細胞構築を維持した。対照的に、72時間以上のインキュベーションで、我々は腫瘍細胞の一部がに開始を示唆し、標本中の凝縮核数の増加に気づいたアポトーシスを起こす。その結果、より長いインキュベーション後の腫瘍組織では、優先的に壊死領域（データは示さず）で周辺が観察された腫瘍細胞を、失われた斑状の領域が含まれている。

これらの腫瘍外植片のサンプルを確実に薬効試験の目的のために利用できるかどうかを調べるために、我々は、TMZの治療の効果を試験した。図A - 2は、本研究における実験の流れを表しています。最近の研究では、TMZの腫瘍内注入は、この薬²の全身投与に比べて悪性神経膠腫の成長制御に関するより強力な効果を持っていることが示された。 16時間インキュベーション後、これらの外植片はパラフィンと連続切片で埋め込まれていた染色用に調製した。 TMZ処理したGBM組織の免疫組織化学では、対照試料と比較してのKi - 67陽性の腫瘍細胞の大幅な減少を示した。ターン、アポトーシスのマーカーと免疫組織化学、カスパーゼ3、でTMZ処理した神経膠腫の標本と対照サンプル（図A - 3）の間に有意差は得られなかった。

TMZによる治療効果は、さらにin vitroでの培養やフローサイトメトリーのどちらかと一緒にこの外植片アッセイを組み合わせることによって特徴付けられた。具体的には、幹細胞様の腫瘍細胞（SCLTC）への影響を判断するように努めた。したがって、TMZによる腫瘍治療後、我々はこれらの腫瘍外植片の分析とフローサイトメトリーを形成する球体を行った。 TMZ処理した試料は、個々の単一細胞に解離し、これらの単セルは、bFGFおよびEGFを添加した無血清培地で96ウェルプレートに（1リットルあたりのセルまたは低い）低密度で播種した。対照群では、腫瘍外植片からの腫瘍の球の形成は、7日間のインキュベーション後に観察された。球の形成がSCLTC ^{3 4}のプロパティであることを考えると、薬物治療による腫瘍球数の変化はSCLTCへの影響を示している。同様に、細胞表面マーカー、CD133と解離腫瘍外植片のフローサイトメトリーは、SCLTCの効果を検証するために実施した。 GBMの異種腫瘍細胞におけるSCLTCが選択的に薬物治療で根絶されている場合、人はそのフローサイトメトリーは、処理によるCD133陽性割合（データは示さず）の減少を検出する必要が予測するかもしれない。

患者のGBMのFigure.1磁気共鳴画像（MRI）。プレ操作図- 1aと後の操作図- 1bの代表人物。図- 1cは、新鮮なGBMの組織サンプルのH＆E染色である。オリジナルの倍率、40倍。

図。 2ブロックの培養実験の実験的なフロー図 - 2A。新鮮な外科GBMの画像は、病理学の部門から受け取った。図- 2bは、ヘルプ外科ブレードと10ミリメートルの小さな部分に腫瘍ブロックの解剖を示しています。図- 2cは、インスリンの注射器を用いて腫瘍ブロックの薬剤（TMZ）治療です。

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図。活性化カスパーゼ-3とKi67とDMSOまたはTMZを注入GBM組織ブロックの3免疫組織化学。免疫組織化学。ヘマトキシリン​​は核染色のために使用されていました。オリジナルの倍率、40倍。

ディスカッション

現在前臨床実験モデルにおける薬効および患者における有効性の間にギャップがある。具体的には、脳腫瘍の研究分野、新たな信頼性の高い方法で現行の方法や患者の有効性と薬物評価との間の既存のギャップを埋める手助けすることを要求され​​る。この研究では記載のアッセイは、影響を受けた患者の実験データと結果の不一致を充填容易にするソリューションを、追加の資産であり、そうでない場合。

in vitroの培養細胞に優先的に関係なく、培養条件の特定の腫瘍細胞のタイプを展開し、腫瘍全体の唯一の亜集団を表す^。5を加えて、人工的な細胞の増殖の遺伝子と表現型の変換が発生し、長期的な細胞培養では避けられない。悪性神経膠腫を治療するための主要なハードルの1つは、単一の腫瘍内および腫瘍サンプル^6,7の間に両方とも、腫瘍細胞の不均一性である。したがって、関係なく、一種類または別の腫瘍細胞の特定の集団の選択的濃縮には、異種腫瘍細胞上の任意の化学療法剤の有効性を判断するために適切な手段ではありません。の亜集団から派生した脳腫瘍の^{8 9}任意の動物モデル腫瘍細胞は小集団での薬効のランプではなく、腫瘍全体を流した。

いくつかの制限が、その一方で、依然としてこの腫瘍外植法に残ります。そのような制限は、治療の比較的短い期間です。悪性腫瘍の細胞が時間をかけて治療、ほとんどに耐性を獲得すると考え、すべてではないされているので、最近で報告されたとして、短期的な腫瘍細胞増殖の初期制御は、長期的な患者の予後に反映されない場合があります抗血管新生阻害剤、ベバシズマブ^10。したがって、長時間の組織を維持するために、この植アッセイのためのプロトコルの改善は今後の調査で必要になります。別の質問では、腫瘍のSCLTC上でテストされた薬剤の特定の効果です。 SCLTCは悪性神経膠腫のための現在の治療に比較的耐性のある、強力SCLTCを根絶する新規抗がん剤の同定が正当化されることを考える。この点に関し、我々は現在、ニューロスフェア形成アッセイなどのin vitroの実験、（データは示さず） の後続でこの外植片アッセイを組み合わせることを目指しています。我々は、これらを組み合わせたアッセイを通してSCLTCで薬剤候補の、もしあれば、効果についての詳細を学ぶことを期待しています。最後に、腫瘍サンプルの小さなブロックを使用するなどの手術標本から、従来の腫瘍細胞株や初代培​​養の場合と同様に、腫瘍全体の細胞集団を反映していない場合があります。さておき、これらの問題は、血管ニッチを含む腫瘍間質を、維持し、腫瘍細胞のための環境要因を特徴付けるのに有用です。したがって、このアッセイでは、より生理学的に妥当な条件の下で任意の治療戦略を評価する可能性があります。

ここでは、GBMの手術標本の植付薬効試験のためのアッセイを確立した。実際には、テスト済みの手術標本で、我々は、TMZの直接注入がGBMの試料の増殖を減少させることがわかった。この組織片の方法は、他の固形がんへの理論的に適用でき、うまくいけば私たちはがんの臨床試験で別の障害を回避することに役立つ患者の腫瘍に対する薬物の有効性を、決定するために資産を提供します。

材料

試薬の名前	会社	カタログ番号
ウシ胎児血清、修飾、熱不活化	GIBCO	16140-071
D-MEM/F-12（1X）液体午前1時01分	インビトロジェン	10565-042
粒状化、精製した寒天	EMD	1.01614.1000
染色のためのDPBS	インビトロジェン	14190
Hematoxyllin	RichalrdアランSCI	7211
10パーセントw / vのホルマリンのCaspase - 3	リッカの化学会社	3810
カスパーゼ-3	R＆Dシステム	AF835
Ki67	ダコ	15626
DMSO	シグマ	D2650
システム-抗マウス想像する	ダコ	2012〜07
想像するシステム - 抗ウサギ	ダコ	2011〜12
DAB -キット	ベクトルラボ。	SK - 4100

表1。材質。

機器の名前	会社	カタログ番号
6ウェルプレート	グライナーバイオone	657160
ペトリ皿	VWR	25384-302
血清用ピペット	Axygen
フィルタのヒント	米国科学的
が500μmポリエステルメッシュNetwe​​llインサート	共演スター	3480
マトリゲルマトリックス	BDバイオサイエンス	354230
BD 10mLの注射器	BDバイオサイエンス	309604
皮下注射針のアルミハブ。	タイコヘルスケア	2000029
組織培養フラスコ	コー​​ニング
遠心チューブ	Basix	5539800
薄肉管	イートン	1107A
外科用ブレードステンレス鋼	フェザー	2976＃10
インスリン注射器	コンフォートポイント	26027
50mLのフラットトップスクリューキャップチューブ	Basix	5539802
解剖顕微鏡	Tritech
蛍光顕微鏡	オリンポス	DP - 72
Forcep	フィッシャー科学

表2。装備。