生体内イオン濃度の測定のための蛍光ナノ粒子

サマリー

私たちの研究室で生産された蛍光ナノ粒子は、そのような生理的恒常性の間のシグナリングおよび間質液中の細胞のような生物学的システムにおけるイメージングイオン濃度とイオンのフラックスに使用されます。

要約

体全体に厳密に制御イオンの恒常性は、脱水などのような衰弱状態の予防に必要です。対照的に^1が 、細胞レベルでの迅速なイオンフラックスが興奮性細胞の活動電位を開始するために必要な²ナトリウムの規制は、の両方で重要な役割を果たしているこれらのケースは、しかし、方法は現在、継続的に生体 ³と^4は、カルシウムプローブと同様の詳細な結果を提供していない細胞内のナトリウムのプローブでナトリウム濃度を監視するために存在しません。これらのボイドの両方を埋めるための努力では、蛍光ナノセンサーは、in vitroおよび in vivo でのナトリウムの濃度を監視できるよう開発されている^。5,6これらのセンサは、イオン選択optode技術に基づくとのナトリウム特異的認識可塑化ポリマー粒子で構成されています要素、pH感受性蛍光色素、および添加物が埋め込 ​​まれている^。7-9機構的に、ナトリウムの認識要素は、センサーにナトリウムを抽出します^。10この抽出が引き起こすセンサ内の電荷の中立性を維持するために水素イオンを放出するpH感受性蛍光体を起こす蛍光の変化。ナトリウムセンサーは、彼らの直径は約120nmである^6。高い細胞内濃度でもカリウムを介してナトリウムを元に戻せると選択的であると生体適合性を付与するためにポリエチレングリコールでコーティングされています。マイクロインジェクションの技術を使用して、センサーは、それらが心筋細胞の拍動の時間的および空間的なナトリウムの動態を監視することが示されている細胞の細胞質内に送達することができます。注入した場合、さらに¹¹彼らはまた、in vivoでのナトリウム濃度のリアルタイムの変更を追跡している皮下マウスへの³ここでは、我々は詳細に説明すると蛍光灯、ナトリウムのナノセンサーを製造するための方法論を示し、簡単に私たちの研究室がためにナノセンサーを使用する生物学的用途を示しています：。細胞内へのセンサーのマイクロインジェクションを、そしてマウスへのセンサーの皮下注射。

プロトコル

1。 optodeの準備

optodeを行う前に、コンポーネントのアリコートは、それらが容易に測定し、保存することができるよう、必要です。

1. 50 mgのナトリウムイオノX（NaIX）バイアル、50 mgのナトリウムテトラキス[3,5 - ビス（トリフルオロメチル）フェニル]ホウ酸（NaTFPB）各tetrahyrdofuran（THF）で育ったと1.5 mlのポリスチレン遠心管に分注しされます。化学煙フードでは、出荷のバイアルにTHF 1mlにNaIXの50 mgを溶解し、固体が完全に溶解していることを確認するために混ぜる。 10個の分離した遠心チューブにこの溶液100μlを移す。 NaTFPBについて繰り返します。 THFは、一晩化学ドラフト内で蒸発させる遠心チューブにラベルを付けたり、保管のための4度の冷蔵庫でそれらを配置することができます。これは、乾燥NaIXとNaTFPBの5mgのアリコートを作成します。
2. THF 1mlにChromoionophore III（CHIII）を溶解し、3 mlのガラスバイアルに移す。任意の残留CHIIIを溶解し、3 mlのガラスバイアルにこれを追加するCHIIIの出荷のバイアルにTHFの別の1 mlの。現在2 mlの合計があるでしょう。テフロンコーティングされたキャップを持つ2つの別々の1.5 mlガラスバイアルにTHF溶液中でCHIIIの1 mlを入れる。 5 mg / mlの最終濃度で4度の冷蔵庫でCHIIIソリューションを保管してください。

これらのアリコートとソリューションはoptode材料を作るために使用されます。

3. ピペットテフロンコーティングスクリューキャップ付1.5 mlのガラスバイアルにビス（2 - エチルヘキシル）セバケート（DOS）の66μlを - これはoptodeバイアルです。 DOSは、粘性の溶液ですので、バイアルに移しているソリューションの適切な量を確保するよう注意しなければならない。ボリュームは、DOSの約60 mgに対応しています。
4. 高分子量ポリ（ビニル）塩化ビニル（PVC）の30 mgを秤量し、optodeバイアルにこれを転送する。
5. 今必要なoptodeを作成するoptodeバイアルに分注し、機能コンポーネントを追加します。 CHIII、NaIX、およびNaTFPBの相対濃度は、ナトリウムに対するセンサーの応答を決定します。これらの濃度は、理想的には150mMのKdを、10mMの、または細胞外濃度のKdで、濃度を細胞内に応答するセンサーを持つように調整することができます。さらに、おそらく正しい応答が化学成分のそれぞれの新しいバッチのために発生しているかどうかを判断するために必要なセンサーのベンダーとキャリブレーションから、化学薬品のバッチ変動へのバッチがあるでしょう。ここでは、通常、細胞内のナトリウムの測定に使用される濃度とセンサーを作成する方法を説明します。
6. 化学煙フードでは、optodeバイアルへのTHF溶液に5 mg / mlのCHIIIの100μlを移す。
7. THF 300μlでNaIXの5mgを溶解し、NaIXの5mgにこの相関、optodeバイアルに300μlを移す。
8. THF500μlにNaTFPBの5mgのアリコートを溶解し、NaTFPB 0.1mgのにoptodeバイアル、この相関に溶液20μlを転送する。
9. optodeバイアルにTHFの80μlを添加する。
10. optodeバイアル内の溶液は、塩ビ、DOSの60mgの、NaIX、NaTFPB、THF500μlのでCHIIIのは0.5mg 0.2mgの5 mgの30 mgを含んでいます。穏やかにボルテックスこのバイアルは、PVCのすべてになるまで溶解した。 optodeは赤い色になります。バイアルに加えTHFの合計金額に関係なく使用されるコンポーネントの割合の500μLにする必要があります。
11. NaIXとNaTFPBアリコートの残りのTHFが化学物質の適切な量で一晩、再ラベル管を蒸発させる。

2。ナノセンサーを作成する

1. 10ピペット100μlのmg / mlの1,2 -ジステアロイル- sn -グリセロ-3 -ホスホエタノールアミン- N - 4ドラムのガラスバイアルにクロロホルムで[メトキシ（ポリエチレングリコール）-550]（PEG脂質）。クロロホルムは化学ドラフト内で蒸発させる。このプロセスは、窒素ガスや家の空気を持つソリューションを乾燥させることにより迅速なすることができます。
2. PEG -脂質とのバイアルに、目的の水溶液4mlを追加します。超音波処理の先端の下に研究室ジャックにバイアルを置き、先端が30秒間の低超音波の力で解決し、超音波処理の深さ7ミリメートル程度になるまで、バイアルを上げる。ここでは、½インチの先端径のステップ角で15％の振幅に設定さブランソンデジタル超音波処理を使用してください。水溶液は、すべてのソリューションにすることができます。例えば、我々はtrizmaベースと10mMのHEPES緩衝液pH 7.2を使用するセンサーの応答を決定する。
3. ソリューションを超音波処理されている間、0.6 mlのマイクロ遠心チューブにジクロロメタン50μlとoptode材料の50μlを混合する。さらにミキシングを確保するために、ピペットで混ぜる。
4. 3分間超音波処理する超音波処理のコントロールを調整します。超音波処理を起動し、超音波処理しながら溶液中にピペットチップを浸漬し、手っ取り早い、さらに注射で溶液100μlを分注してバイアルにoptode混合溶液を加える。解決策は、青、depeを有効にしてください使用される水溶液にnding。
5. 超音波処理は、その後約30秒間継続する超音波処理チップが溶液中で深さ約2mmになるようにジャッキを下げることができます。これにより、ソリューションを曝気を開始する必要がありますし、解決策が不透明になります。このステップでは、液から残留THF、ジクロロメタンを除去するのに役立ちます。
6. 超音波処理が完了すると、5mlシリンジにナノセンサーソリューションを引き上げます。 0.2μmのシリンジフィルターを取り付け、スクリュートップキャップ付きガラスバイアルにナノセンサーソリューションを分注する。 10mm未満のナトリウムが含まれており、約9未満のpHを有する水溶液が使用されている場合、溶液は透明とブルーになります。そうでなければ、それは色がないかピンクにする必要があります。

3。 nanonsensor応答の決定

このメソッドは、細胞内のナトリウムを測定するために設計されたナノセンサーの応答を決定するために使用されます。異なる濃度は、細胞外ナトリウム濃度のナノセンサーに使用することをお勧めします。

1. 10 mMのHEPES（0 NA）と10mMのHEPES（1 M Na）をし、pH、これらのソリューションの各7.2〜trizmaベースを使用して1Mの塩化ナトリウム（NaCl）のストック溶液を作る。 0、1、5、10、20、50、100、200、500、1000 mMのNaCl濃度：でソリューションを作成するために50 mlコニカル遠心チューブに0のNaと1 M Naのストック溶液を混ぜる。
2. 応答を決定するために光学底96ウェルプレートを使用してください。列の3ウェルにナトリウムのそれぞれの濃度の100μlを追加。これは3 × 10ウェルの配列を生成します。
3. 各ウェルマイクロプレート蛍光光度計に作りたてのナノセンサーと、負荷の100μlを加える。我々は、分子デバイスSpectramax M3を使用してください。
4. 以下の波長で各ウェルを読む：

励起（nm）の	放射（波長）	カットオフ（NM）
488	570	530
488	670	610
639	680	665

各波長におけるナノセンサーの強度は、ナトリウム濃度に依存しています。波長の使用は、アプリケーションに依存します。細胞内のスローダイナミクスの測定では、我々は488 nm/570 nmの（励起/発光）と比率2つの波長をするために私達を許可し、ノイズを低減488 nm/670 nmを使用して。

5. 伝統的に、optodeデータがある値に変換されます：α=（I - I _分）/（I maxと-私_分 ）、私は与えられたナトリウム濃度で強度です、私は_分が応答測定における最も低い強度である、そして私_の最大の応答測定における最高の強度です。強度の比は、670 nmの強度やαから680 nmの強度で割った値570nmでのどちらかに変換します。
6. 作図用ソフトウェアを使用して、Excelや起源のどちらかが一般的に-1にゼロナトリウム濃度のログを設定し、ナトリウム濃度の対数対αをプロットするために、私たちのラボで使用されています。応答にS字状曲線をフィット。曲線から、センサーが最適に応答する濃度を表すα= 0.5でのナトリウム濃度を計算する。
7. 興味のナトリウム濃度の周りに最適な応答とナノセンサーを作成するoptodeでCHIII、NaIX、およびNaTFPBの比率を調整します。

4。細胞内イメージング

1. 細胞内の測定では、ナノセンサーは、水中に5 mg / mlのグルコースで行われ、細胞にマイクロインジェクション。
2. 成長やガラス底皿やガラスのカバーの底部と画像処理チャンバーに細胞を移す。
3. 明確なメディアやタイロード液で細胞をインキュベートする。落射蛍光顕微鏡に画像処理室や料理をマウントします。我々はツァイスLSM 7共焦点顕微鏡を使用してください。
4. ピペットプラーとガラスキャピラリーを引き出します。我々は300から500 nmの最終的な先端径には、1mm径、0.78 mm内径のガラスと茶色のp - 97燃えるサターを使用してください。
5. 埋め戻しナノセンサーシリンジとハミルトンの針を使用してソリューション、またはマイクロチップローダーとピペットとピペット。
6. マイクロマニピュレータに取り付けられ、圧力制御噴射システムに接続されているホルダーにピペットをマウントします。ここでは、バーレイEXFOのPCS 6000マイクロマニピュレータとメディカルシステムズ株式会社インジェクタを使用してください。
7. セルの上にピペットを下げ、細胞質中に、時にはそれがピアスに膜をマニピュレータのホルダーを"タップ"する必要があります。ナノセンサーソリューションを注入し、迅速にピペットを撤回。

（5）in vivoイメージング

すべての手順は、ノースイースタン大学の動物実験委員会によって審査され承認されている。

1. ナノセンサーin vivoでのために、細胞外イメージングは、リン酸塩で作られている緩衝生理食塩水および135 mMのナトリウム濃度のナトリウムに対する最適な応答を持つように調整。
2. インジェクションのセットアップとマウスの蛍光ナノセンサーのイメージングのため、我々は、IVISルミナIIおよびそれに関連する麻酔のユニットを使用してください。誘導とイメージング室を消毒する。誘導チャンバ内の場所CD1ヌードマウス（約20グラム）とイソフルランにそれらを公開する。 投与イソフルランと酸素流量の割合は、マウスの種と重量によって異なりますが。完全に麻酔になるためにマウスのを待ちます。
3. マウスに麻酔をしたら、画像処理チャンバー内に誘導室と場所からマウスを取り外します。麻酔下でマウスを保持します。それぞれのマウスの場合は、希望する注入領域を消毒する。
4. すべての気泡を除去することを確認してナノセンサーの10μLを滅菌した31Gインスリン注射器を埋める。
5. 鉗子を使用して、目的の注射部位でのマウスの背面に沿って皮膚の小さな倍を把握する。皮膚をつかんで、上向きにベベルと皮膚と皮膚に針を平行に注射器を挿入する。
6. センサーを注入する前に、針が血管内に挿入されないようにシリンジのプランジャーを後方に引いて。その後、そっと針を右に移動し、皮膚内ポケットを作成するために残しました。これは、センサーが注射部位から漏れする原因となる背圧を最小限に抑えることができます。センサーを注入し、静かに注射器を取り外します。
7. ゆっくりと注射部位に圧力を適用し、注射部位から漏出した可能性のあるソリューションを拭き取ってください。これは皮膚に注入されていないセンサーからの蛍光が最小限に抑えられます。
8. 希望の注入領域の数に達するまで繰り返されますから5.7 5.4繰り返します。均等にバックの左側と右側に間隔をあけ六注射部位が推奨されています。針が皮膚に挿入することが困難になった場合、個々のマウスの場合は、針を変更してください。 針はマウス間で共有すべきではない。これは、マウスの間で病気の伝送やクロスコンタミネーションを最小限に抑えられます。
9. イメージングナトリウム蛍光センサについては、我々は、最も近い640 nm/680 nmの（励起/発光）ナノセンサーのスペクトルに一致し、それはまた、皮膚の自家蛍光を最小限に抑えるフィルターセットを使用してマウスの明視野および蛍光イメージの両方を取得する。

6。代表的な結果

図1。ナトリウムの5種類のナノセンサーセットの応答曲線。各セットはCHIII、NaTFPB、PVCとDOSの同じ量だけNaIXの様々な量を持っていた別のoptode製剤からナノセンサーを表します。データは、680分の639 nmの強度を用いてα値に変換されていました。データは、Originを使って近似S字カーブで、明確に省略さ3、エラーバーの平均です。この応答曲線では、使用されるナトリウムの最大濃度は500 mmであった。ナトリウム、ナトリウムのナノセンサーのKdは、10mM（オレンジ色のダイヤモンド）から約150mm（黒い正方形）の範囲であった。

図2新生児心筋細胞を注入した。細胞は、顕微鏡に装着され、ナトリウムのナノセンサーを注入、カバーガラス上で培養した。蛍光（639 nm励起）、明視野、およびオーバーレイも表示されます。いくつかのセンサーのクラスタリングが発生するが、細胞が正常な形態を持って、センサーは細胞質全体に拡散しているとは核の負荷がないことに注意してください。

ナトリウムのナノセンサーを持つマウスの図3。皮下注射。ナトリウムのナノセンサーの9種類の注射は、ヌードマウスの皮下空間に作られた。明視野と蛍光像（680分の640）の両方が重ね合わされる。

ディスカッション

optodeソリューションが行われ、PEG脂質は乾燥された後、ナノセンサーの形成は、10分以上も時間がかかるはずです。必要なときOptodeだけ迅速に行うことはできませんが、摂氏4度で保存した場合、彼らは数ヶ月のために安定させることができる。しかし、ケアは光からナノセンサーをブロックすることにより、この時間の経過とともに退色を防止するためにとるべき⁶ナトリウムのナノセンサーは、ここに示されたが、optodesがされている;。私たちは、一度形成nansensorsが、、少なくとも1週間溶液中で安定であることが示されているこのようなカリウムと塩化物のようなほとんどの生物学的に関連するイオンのために作成^。10,12また、グルコースなどの小分子には、この技術を拡張しました^。13

別の検体を監視するためのナノセンサーを生成するだけでなく、これらのナノセンサーは、ほとんどの生物学的実験において、それらを有用になるその他の変更に適している。例えば、表面コーティングが、この場合、ポリ（エチレングリコール）は、容易に水溶性である任意の両親媒性分子を使用して変更することができます。これにより、異なるアプリケーションまたはターゲットのためにこれらのナノ粒子を官能の可能性を可能にします。ナノ粒子のサイズは、表面コーティング、超音波処理の強度や溶剤を変えることによって調整することができます。

カルシウム蛍光指示薬は、細胞内カルシウムシグナル伝達を決定する上で非常に貴重されているが、使用可能なナトリウム感受性色素は同じ理想的な特性を持っていません。 Optodeは、我々は、うまくいけばナトリウムのシグナル伝達が細胞機能に影響を与えるかを理解するための手段を提供する細胞内のナトリウムのイメージングのための特定のナノセンサーを作成するには、この以前の研究で構築されている^14。細胞内に年間の開発にされているイメージングイオンのための代替方法を提供することを目的とナノ粒子特定の疾患につながるシグナル伝達の変化。

in vivoでの蛍光ナノセンサーの使用は、血液が描くような他の方法より分析物を監視するためのリアルタイムの低侵襲代替手段を提供しています。上記の技術に基づいて³ナトリウムとブドウ糖ナノセンサーは、ナトリウムとブドウ糖の変化を追跡することが示されている、それぞれの生体 ^。3,13はしかし、現在、監視ツールとしてこの方法に制限が存在する。例えば、センサーは十分に皮膚からのバックグラウンド蛍光を最小限に抑えるために、赤近赤外にシフトスペクトルを持つ蛍光体が含まれている必要があります^。15秒、電流注入法などによって発生する可能性があるナノセンサーの均一な注入を生成しない注入の深さのばらつきなどのエラー。これらの制限があるにもかかわらず、これらの蛍光ナノセンサーとその成功デモの開発は、患者の健康状態を監視するため、これらのセンサーは非常に貴重な研究ツールと方法することができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
製品名	会社	カタログ番号	コメント
IVISルミナIIのインストゥルメントのパッケージ	キャリパーライフサイエンス	126273
CD - 1ヌードマウス	チャールズリバー	ひずみコード：086	免疫不全
インスリン注射器	BD	328438	3月10日CC mLを 、8mmの31G
高分子量ポリ塩化ビニール	シグマ
DOS	シグマ
CHIII	シグマ
NaTFPB	シグマ
NaIX	シグマ
薄壁ガラスキャピラリー	サター
PEG脂質	アヴァンティ極性脂質