相関ライト/電子顕微鏡のための低コストクライオ光学顕微鏡のステージの作製

サマリー

我々は、最も反射光顕微鏡に合うように設計された低コストの低温ステージの製造を実証する。このラボに構築された極低温ステージには、低温光と低温電子顕微鏡との間の効率的かつ信頼性の相関イメージングを可能にします。

要約

低温光顕微鏡（極低温- LM）のカップリングと低温電子顕微鏡（クライオEM）は、細胞のダイナミクスと超微細構造を理解するための多くの利点をもたらす。最初に、細胞は、両方の技術のためのほぼネイティブ環境で撮像することができます。ガラス化プロセスのために、第二に、サンプルは迅速な物理的な固定化ではなく、ゆっくりと化学的固定によって保持されます。第三に、イメージングは​​クライオ- LMと低温電子顕微鏡の両方で同一のサンプルは、単一のセルではなく、"代表的サンプル"の比較からのデータの相関関係を提供します。これらの利点は、先行研究から知られているが、相関クライオ- LMと低温電子顕微鏡のままの普及は、適切な極低温光顕微鏡のステージを買うか、または構築の費用と複雑さにも制限がある場合があります。ここでは、アセンブリを示す、と地元のハードウェアとの食料品店で見つけた部品を以下の40ドルで、任意の研究室で作製することができる安価な極低温ステージを使用してください。このクライオ- LMステージは、長作動距離の空気の目標を装備している反射光顕微鏡用に設計されています。相関クライオ- LMと低温電子顕微鏡の研究では、試料の支持体として、カーボンコーティングされた標準の3mmの低温電子顕微鏡のグリッドの使用を適応させる。グリッドにサンプルを吸着した後、サンプルをガラス化して転送する/グリッドを処理するために、以前設定されたプロトコルは、マルチ技術のイメージングを可能にするために続いている。その結果、この設定は、反射光顕微鏡での検査では、凍結水和試料の直接の相関イメージングへのアクセス権を持つことができます。

プロトコル

1。製造と組立

1. 。。図1cに示すように、22.96センチメートル（9"）パイ、パン、パンの側面から約2cm、黒のマーカーペン、アルミのヒートシンクのマークの穴（注）を使用して、内部のアルミ製ヒートシンクを置きます：場合、アルミブロックは、（少なくともローカルの金属スクラップの店またはオンラインで購入http://www.onlinemetals.com ）事前にあけられた穴に付属していない、あなたは穴がドリルとアルミを確保するためにステップ1にする前に皿持って手配する必要があります。パイ皿にブロックする。我々は、窒素ガスの気泡がアルミの下から脱出を可能にするために、プラットフォームと4余分な穴にブロックを確保するために5穴を使用する。
2. アルミのヒートシンクの位置に近い低温グリッドボックスを配置し、ノッチと各側面をマーク。
3. アルミ製ヒートシンクの穴のための＃17のドリルビットと低温グリッドボックスの穴のための＃35ドリルビットを使用してマークされた位置のためのパイロット穴を開けます。
4. 5を使用してアルミのヒートシンクをマウント - ＃10、1.9センチメートル（3 / 4"）平頭溝付きボルトと対応するナットと同様に15 - ＃10ワッシャ場所2つのアルミニウムのブロックの下にワッシャーとの裏面上のサード。各ホールのためのパイのパン注：表示領域の近くにアルミブロックの無担保オーバーハングは、ステージのイメージング機能を制限する振動が発生する可能性がすべての取り付けボルトがしっかり締まっているかを確認してください。。
5. 挿入3 - ＃4、0.95センチメートル（3 / 8"）低温グリッドボックスマウントとして機能するようにパイのパンの裏側からマイナスボルトと対応するナットを丸めます。
6. 別の頂上one箸とペアで一緒にテープ4箸。スペーサーとして機能するようにケーキ型の反対側の端にテープをそれぞれのペア。
7. ケーキやパイのウェットトップとボトム面はのddH _{2 O}でそれぞれパン
8. スプレー断熱材の2層のケーキパンを埋める。次のステップに進む前に各レイヤーを濡らす。
9. 泡にパイ皿を押してください。
10. スペーサーは、パイのパンをご連絡するまで、上下逆さまにフライパンをひっくり返してケーキ型に押してください。ケーキのパンの上の任意の加​​重オブジェクトを配置し、治すために一晩放置します。
11. 鋸歯状のナイフで、過剰にフライパンの端から絶縁スプレーフォームを乾燥し、箸を削除切り取る。
12. パイのパンからケーキのパンを取り外します。アルミヒートシンク付き円グラフのパンは現在、絶縁され、"極低温ステージ"（図1a）と呼ぶことにする。
13. 極低温ステージの上に透明なプラスチック製のクリップボード（任意の色と厚さ3 mm以上）を配置します。黒のマーカーで約1.5倍の単回低温グリッドボックスの直径の円を描画することにより低温グリッドボックスのマウントの位置とマーク。 1.9センチメートル（3 / 4"）で穴を切り取って穴を見た。このクリップボードは、と呼ばれる"ローディング画面"（図1b）を。
14. 極低温ステージと直接対物レンズの下に、ヒートシンク付き顕微鏡での場所の上に新しい透明なクリップボードを置く。彼らは回転と黒のマーカーで、目的のパスをマーク。
15. クリップボードの縁から半円を取り除く印を付けた行に沿ってカット。これは、ジグソーパズルやビデオに示すように穴が複数回見た7.62センチメートル（3"）を用いて行うことができます。
16. 最後に皿の領域内ではまだ離れて半円形から1.9センチメートル（3 / 4"）穴を開けるが、これはレベルが低下しばらくイメージング場合、液体窒素（LN _2）を補充するためのポートとなる。これはクリップボードが参照されます。 "表示画面"（図1C）などへ。

2。サンプル準備

1. 水で^{1 × 10 6}細胞/ mLの適当な濃度に合成完全（SC）メディアに成長相の酵母細胞をログに記録希釈する。
2. 希薄化後の酵母の2mLをR2 / 1 400メッシュ穴あきカーボン被覆銅低温電子顕微鏡のグリッド（SPI用品、ウエストチェスター、ペンシルバニア州）にピペットで、15秒間吸着されている。
3. 2秒間のソフトセルロースの組織の引き裂かれた部分（キムワイプ）にグリッドの背面に触れることにより、グリッドの表面から余分な液体をブロット。
4. 必要であれば、グリッドは後方からブロッティングにより水の3μL滴（1〜3回）で洗浄し、そして邪悪な離れて、ステップ3とすることができます。
5. 最後の洗浄の前に、サンプルは、空気圧のプランジ冷凍庫にロードされ、吊りグリッドは、ステップ2.4​​のように洗浄される。表面からの水の大部分を除去するために引き裂かれたティッシュペーパー（キムワイプ）でグリッドをブロッティング後、グリッドはLN ₂に陥っている液体のエタンを冷却し、ストレージ¹の低温グリッドボックスに転送注：。行うことが重要です。サンプルは、水分を保つために表面に可能な限り薄く液体の層を残す。不適切なブロット法のいずれかのサンプルを乾燥させたり、電子ビームに対して不透明な氷のままにします。

3。クライオ光顕微鏡

1. と極低温ステージを埋めるLN ₂と素早くローディング画面（単1.9センチメートル（3 / 4"）穴とプラスチッククリップボード）でカバー。
2. 一度金属はLN ₂温度に達すると、一部A5で説明されている3本のネジで作成したマウント1.9センチメートル（3 / 4"）ローディング画面の穴に通して転送に低温グリッドボックスを転送する。ゆるめ低温グリッドボックスそのホルダーから改善されたアクセスのためのホルダーを取り外す。ステップ3.10まで別々のデュワーに_液体窒素で低温グリッドボックスホルダーを保管してください。低温グリッドボックスは、サンプルのグリッドの温暖化を防ぐために、LN _2の下に保つ必要があります。
3. 。にちょうどアルミのヒートシンクの上、以下の極低温ステージの詰め替えLN ₂ 注：LN ₂レベルが定期的にチェックし、LN _2は 、ヒートシンクとの接触で連続的であることを保証するために、イメージングプロセス中に補充する必要があります。一般的には、補充は表示画面で充填ポート経由で10分ごとに発生します。
4. LN ₂のプレクールピンセットの先端、その後1.9センチメートル（3 / 4"）ロード画面の穴を使用して、ピンセットでアルミのヒートシンクの平坦な視野の表面に、グリッド（s）を転送する。
5. 慎重に反射光顕微鏡の目的開口部の下にクライオステージを移動する。
6. ローディング画面の上に透明の視聴画面を置きます。その後、徐々に表示する画面の下にスライドさせてロード画面を削除する注意：この時点で、サンプルは、最も脆弱である。顕微鏡の周りのすべての空気の流れを含めて、最小化する必要があります：呼吸、近くのドアの開口部、過去を歩く人々、等我々はフェイスマスクを着用したり、予防措置として、顕微鏡の接眼レンズ下に透明フェイスシールドをぶら下げ示唆している。
7. クライオステージと平板ヒートシンクの表示エリア上のサンプルのスキャンの冷窒素ガスの環境への対物レンズを回転させる。標準の明視野光学顕微鏡技術を使用すると、センターを検索し、全体像を撮るために、低倍率の対物でグリッドに焦点を当てる。この実験に用いた光学顕微鏡レンズに関する仕様の実験材料に記載されている注：LN _2は、対物レンズに接触していないと我々は画像や冷却の影響からレンズへのダメージの劣化を未だ見たことがありません。
8. 関心のある領域に高倍率で焦点と明視野、暗視野、偏光または蛍光イメージングを使用してデータを取得する。将来の相関のための低倍率明視野画像上の関心領域の位置を記録してください。 LN _2を補充するため上記のすべての処置がとられている場合は、蒸発窒素から正圧は、イメージングの期間中、汚染のない環境を（部屋の湿度に依存しない）を維持するのに十分です。
9. 完了したら、表示画面の上部の上にスライドさせて、ロード画面を交換してください。ロード画面の下にスライド遅くすることで表示画面を削除します。
10. 顕微鏡からクライオステージを削除し、予冷ピンセットで、低温グリッドボックスに戻ってグリッドを転送する。環境に対するシールとストレージおよび将来のイメージングのための液体窒素デュワーにホルダーを転送するために低温グリッドボックスに低温グリッドボックスホルダーをねじ込みます。

4。クライオ電子顕微鏡

1. 常に液体窒素の温度で試料を保持しながら、標準と確立された技術に続いて、クライオEMの転送ホルダーにサンプルのグリッドをロードします。
2. 透過型電子顕微鏡にサンプルグリッドでクライオホルダーを挿入します。
3. 適切な低倍率のビュー（50 - 500倍公称倍率）で、サンプルのグリッドの中心を見つける。
4. グリッドの中央の銅のタブの相対的な向きを（図2で説明したように）を決定し、相関のための関心の正確な領域を特定するために、ステップ3.7から以前に収集された、低倍率クライオ- LMのデータを使用してください。
5. 顕微鏡のアライメント、低用量低温電子顕微鏡イメージングとデータ収集を続行します。

5。代表的な結果

極低温ステージ（図1a）は、低温蛍光顕微鏡と相関cryo-LM/cryo-EM解析のためのクライオ- LMのデータを収集するための効果的な方法です。図2は、低と高倍率クライオ- LMの画像の組み合わせは、あなたがクライオEMの特定の領域への直接参照マップを作成できるようにする方法を示しています。結果として得られるクライオ- LMリファレンスマップ（図2b）は、図3に示すように正確な領域を見つけるために低温電子顕微鏡データの取得中に利用されました。

図1 極低温ステージが 。）極低温ステージのレイアウトは、低温グリッドボックス転送マウントで構成されていますwを示さi番目の白い矢印とアルミ製ヒートシンク。グリッドは、低温グリッドボックスからLN _2の下で転送され、黒の矢印で示すように、ヒートシンクの表示領域上に直接配置。b）画像は、画面のロードに極低温ステージを描いたされています。ローディング画面の穴は、サンプルを転送するポートとして、ピンセット等でヒートシンク上の領域を表示するサンプルに低温グリッドボックスからサ ​​ンプルを移動するための低温グリッドボックスマウントと行為の上に直接配置されます。C）極低温場所の表示画面と対物レンズの下の位置でのステージ。視聴画面上に特殊なカットアウトは、対物レンズが簡単に極低温ステージを移動することなく所定の位置に揺動することができます。離れてサンプルエリアから表示画面の穴は、必要に応じて、LN _2つのレベルを補充するためにポートを埋めるLN ₂として動作します。

図2。 相関研究のためのクライオ- LMに移動。サンプリンググリッドに付着した酵母細胞の）低倍率クライオ- LMビュー。関心のある領域の高倍率蛍光画像を重ねb）同じ画像の（）と満たされたオレンジ色の多角形でサンプルのグリッドの中心をマーキング。センターは4つの正方形、余分な金属製のタブや前後のオープンを持つ3人のグループで構成されています。余分な金属製のタブを持つ3つの正方形の場合は、2対の不斉中心を形成し、長いと短い軸についてのタブを共有する。この不斉中心は、左上隅に見ることができるとクライオ- LMと低温電子顕微鏡との間のグリッドの回転角度と利き手を示すために使用されていました。いずれかから関心の低倍率の画像多くの分野は、低温電子顕微鏡で同一の領域を特定するために、参照マップとしてマークされ、使用することができます。（B）における関心の領域のc）の拡大蛍光クライオ- LMイメージ。 HTA1 - CFP、C末端CFPヒストンマーカーは、核の位置をラベル緑斑点状の構造として見ることができます。（C）に対応したエリアのd）の低温電子顕微鏡の画像。 スケールバーは50ミクロンを表す。

クライオ- LMと低温電子顕微鏡の 図3。 相関。クライオ明視野（、D）と相関同一の酵母細胞を示す図の2つのフィールド、低温蛍光（B、E）、および低温電子顕微鏡（C、F ）。 スケールバーは5ミクロンを表す。

ディスカッション

私たちの極低温ステージ及び試料調製技術、クライオ- LMと低温電子顕微鏡との間の相関の研究を使用することを含め、これに限定されないが近づくと、従来の室温以上のいくつかの利点を示す：迅速な固定を ^1,2、退色に低減 ³、および低温電子顕微鏡の前にサンプルの完全性のスキャン ^4,5または化学的固定/埋め込み ⁶。クライオEMのデータ収集のためのボトルネックの1つは、TEMにサンプルを転送し、画像に適した領域を見つけるためにグリッドをスキャンの両方に必要な時間です​​。クライオ- LMの迅速なデータ収集と ⁵、時間は大幅に削減することができる良好なセルを見つける過ごした。従って、我々は時間と費用を節約し、事前にスキャンして、クライオ- LMへの関心の領域をマッピングすることにより、このボトルネックを緩和することができます。

その他の高価または複雑な極低温の段階では、高分解能クライオ- LMのイメージングを可能にすることができる。しかし、ここで製造された段階では、多くのアプリケーションで十分です。テキストとビデオで説明されているようにクライオ- LMのイメージングとサンプルグリッドの転送が慎重に行われている場合、完全に汚染無料イメージングを達成することができる。このメソッドは、同じ細胞、細胞小器官や高分子複合体の蛍光と電子顕微鏡データの直接的な相関関係は、カーボン担体上に分散または薄い組織切片に含まれることが可能 ⁷。それは、この極低温ステージの値が全体として光学顕微鏡の分野にcryo-LM/cryo-EM相関の研究を超えることに留意すべきである。この極低温ステージがよく繊細な試料と蛍光団の染料/汚れの両方に適しています ⁸、量子ドット、または蛍光タグタンパク質 ⁹それは、グルタルアルデヒドとパラホルムアルデヒドで室温の化学的固定と包埋時に不安定になることがあります。その結果、我々は、この極低温ステージは、以前にコストと不十分なアクセスによって抑止されているクライオ- LM、興味のある人へのより大きなアクセスを提供することを願っています。

トラブルシューティングクライオ光学顕微鏡

1。サンプル吸着：異なるサンプルでは、​​カーボン担体への変数の吸着特性を示すことができる。このような連続的な炭素、穴あきカーボン、またはサンプルをサポートするためのformvarコーティングされたグリッドのような他の種類のサポートのグリッドを使用することが必要になるかも知​​れません。サンプルではグリッドではなく、炭素表面の銅バーへのバインディングの場合はさらに、、それが湿潤剤を使用してグリッドをインキュベートすることにより、または前のサンプルのほかに放電グローによる炭素表面の化学的性質を調整する必要があります。

2。ステージの安定性：あなたが振動に気付いた場合、それは可能性が高い重量ではなく、液体窒素のバブリングで過負荷にされているサンプルの段階によるものです。極低温ステージの追加重量は、時々標準的な3軸の旅行の顕微鏡ステージに沿って送信するために低周波の振動を引き起こす、と否定的にぼかしを経由して画像に影響を与える可能性があります。これは、簡単にビデオに示すように、二重ネジの腕を持つ調整可能なミニリフトまたは調節可能なアダプタのいずれかで下から顕微鏡の旅行の段階をサポートすることによって修正することができます。これらの調節可能なサポートメカニズムの両方は、旅行のステージの非可動部分と相互作用し、したがって、イメージングに必要としても、XとY軸の変換を許可します。

材料

特定の試薬と機器の表：

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
の名前	会社	カタログ＃	コメント	コスト
1〜22.86センチメートル（9"）傾斜したエッジを持つパイのパン	グッドクック		地元の食料品店	4.39ドル
1〜22.86センチメートル（9"）ケーキパン	グッドクック		地元の食料品店	4.93ドル
箸の4組			地元の食料品店	0.50ドル
1 - 素晴らしいもののスプレーフォーム	素晴らしいもの		地元の金物屋	5.98ドル
1 - アルミの4センチメートルx8cm x1cmブロック			地元の金物屋や金属のスクラップヤード	10.00 $
5 - ＃10 1.91センチメートル（3 / 4"）平頭溝ボルトW /ナット			地元の金物屋	0.98ドル
3 - ＃4 0.95センチメートルは（3 / 8"）溝付きボルトW /ナットを丸める			地元の金物屋	0.98ドル
15 - ＃10ワッシャ			地元の金物屋	0.98ドル
2 - 透明なプラスチックのクリップボード			ローカルオフィスストア	6.84ドル
1 - 低温電子顕微鏡のグリッドボックスホルダー	テッドペラ	160から41		N /
1 - 低温電子顕微鏡のグリッドボックスのハンドリングロッド	テッドペラ	160から46		N /
1 - R2 / 1穴あき炭素膜、400メッシュの銅クライオEMサポートのグリッド	SPI用品	4340C - XA		N /

実験材料

1. 酵母菌株：Hta1 - CFP：：カプランの研究室からKanMX6：カン（KSC - 3382：MATA、URA3 - 52、LYS2 - 801、ADE2 - 101、TRP1 -Δ63、HIS3 -Δ200、LEU2 -Δ1、Hta1 - CFP：カリフォルニア大学デ​​ービス校）。
2. クライオ光学顕微鏡：クライオ光顕微鏡の画像はライカDFC310 FX CCDカメラとライカDM4000M反映して顕微鏡で撮影した。ブライトフィールド、暗視野と蛍光イメージは、HCX PL FLUOTAR 5倍0.15 NA空気の目標、HCX PL FLUOTAR倍0.30 NA空気の目標、PL FLUOTAR 50倍0.55 NA空気の目標やNPLAN 100倍0.75 NA空気の対物レンズを用いて取得した。明視野および暗視野像では、光源として12V 100Wタングステンランプを使用。フィルタキューブ蛍光の場合は、EL6000 UVランプのソースは、ライカJC1（：：BP 30分の480、DM LP 505、SF BP 40分の535＆LP 580 Ex.F.）と組み合わせて使用​​した。
3. クライオ透過型電子顕微鏡：低温電子顕微鏡画像はガタン626クライオトランスファーホルダ（ガタン、米国）を利用した200 keVでJEM - 2100 - FEGの透過型電子顕微鏡（JEOL、日本）オペレーティングシステム上で取得した。顕微鏡写真は、4096 X 4096ピクセルTietz CCDカメラ（TVIPS、Gauting、ドイツ）で50、200、1,200、4,000 Xの公称倍率で記録した。