皮下ジヒドロテストステロン(DHT)治療:多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)のマウスモデル

要約

出典:Xue, P., et al. A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome. J. Vis. Exp. (2018).

この記事では、マウスの多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)をモデル化するためのジヒドロテストステロン(DHT)ペレットを準備して挿入する方法について説明します。この例のプロトコルは、生殖および代謝研究に使用されるマウスでの手順を示しています。  

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

>1. PCOSライクなマウスモデルを作成

>注:この研究で使用したマウスは混合バックグラウンド(C57/B6、CD1、129Sv)であり、24°Cで14/10時間の明暗サイクルで食物と水を自由に維持しました。

1. DHTペレット調製
   1. 滅菌するためのオートクレーブシラスティックチューブ。シラスティックチューブをカミソリの刃で15mmの長さにカットします。
   2. 3mLシリンジに取り付けられた20Gの鈍い針で医療用接着剤シリコーンをチューブに注入することにより、片側を密封します。プランジャーをシリンジから引き出してから、接着剤をリザーバーに挿入します。プランジャーを再度挿入し、接着剤を針から出始めるまで押し下げます。鈍い針は、20Gの針の先端を強いハサミで切って作ります。チューブ内のシリコンの長さは、製造後のトリミングを可能にするために2mm以上にする必要があります。
   3. 一晩乾燥させ、密閉面に気泡がないか確認します。DHTペレットには気泡のないものが使用されます。その他は、DHTなしの防除ペレットにも使用できます。
   4. フードでDHTペレットを作る前に、手袋、マスク、ゴーグル、白衣を着用して、DHTが皮膚に触れないようにしてください。
   5. DHTパウダーをプラスチック製の計量ボートに注ぎ、1.1.1で製造された粘着キャップ付きチューブの開いた面をDHTパウダーに押し込みます。
   6. DHTパウダーは、まっすぐに伸ばした大きなペーパークリップでタンピングできます。DHTが4 mm(または希望の長さ)の高さに達するまで続けます。定規でDHTの長さを確認し、開いた面をシリコンで密封し、一晩乾燥させます。
   7. シールされた各面をカットして、シリコンの長さを2mmの長さにします。ペレットの全長は8mmになります。
   8. 空のシラスティックチューブの両側をコントロール(DHTなし)ペレットとしてシールします。
   9. ペレットは、ホイルで包んだ50mLの円錐形チューブ(光への露出を防ぐため)に室温で保管してください。DHTペレットは、少なくとも3ヶ月間の保存期間、完全な有効性を維持します。
2. DHTの挿入と交換
   1. 最大20個のDHTペレットまたはコントロールペレットを、30 mLの滅菌0.9%生理食塩水を入れた50 mLコニカルチューブに別々に沈め、挿入直前に平衡化するために37°Cで24時間
   浸します。
   2. 手術前に、表面と手袋はクリドックスで消毒され、作業面は清潔なプラスチックで裏打ちされた吸収紙(手術用パッド)で覆われます。動物と接触するすべての器具は、オートクレーブによって動物施設に入る前に除染されます。器具は乾燥させて冷却してから使用してください。
   3. 生後2ヶ月の雌マウスを使用します(4〜5匹/ケージ)。マウスは、インスリン注射器を使用してキシラジン(3.5 mg / kg bw)とケタミン(78.8 mg / kg bw)を腹腔内注射します。.麻酔の混合と投与の計算を表1に示します。
   4. 足の指の反射の喪失と呼吸の鈍化によって測定されるように、適切な麻酔が達成された後、マウスは手術の準備をします。
   5. 滅菌ガーゼを使用してその領域の皮膚をベタジンで消毒し、70%エタノールで洗浄します。その領域は再びベタジンで塗装されます。
   6. 首の近くの皮膚の下にハサミで長さ5mm前後の穴を開けます。10Gのトロチャーを使用して、吻側に小さなトンネル(15mm)を作ります。ペレットはトロチャーと一緒に背側に挿入されます。
   7. 次に、開口部を外科用接着剤で密封します。鉗子と穏やかなブラッシングストロークで創傷の端を手動で近似し、近似した創傷の端に液体接着剤の薄膜を塗布します。接着剤を3つの薄い層に蓄積して、接着剤が傷口全体に均一に分布するようにします。接着剤は、塗布された創傷端の両側に1cm伸びている必要があります。縫合糸または外科用クリップを使用して穴を閉じることもできます。マウスをケージに戻し、個別に収容し、回復用のヒートパッドを付けます。4週間ごとにペレットを交換して、アンドロゲン曝露を一定レベルに維持します。元のペレットが取り除かれ、新しいペレットが上記のように同様の位置に挿入されます。

ケタミン (100 mg / mL)	キシラジン (100 mg / mL)	塩田 △0.9%
175 μL	15μL	810μL
作業溶液の腹腔内注射:0.1 mL/体重20g

テーブル 1.ケタミン/キシラジンカクテル。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
結晶性5α-DHT粉末	シグマ・アルドリッチ	A8380-1G
Dow Corning Silastic チューブ	フィッシャーサイエンティフィック	11-189-15D	0.04インチ/1mm内径×0.085インチ/2.15mm外径
医療用接着剤シリコーン	Factor II, InC.	A-100
ゴーグル、白衣、手袋、マスク
3 mL シリング	ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー(BD)
付属針:20G	BD	305176
定規:ミリメートルスケールで10cmを超える任意の長さ。
キシラジン	Vet one AnnSeA LA、MWI、ボイジー	NDC13985-704-10	100 mg/mL
ケタミン塩酸塩	ホスピーラ株式会社	NDC 0409-2051-05	100 mg/mL
外科用ステープル	AutoClip®システム、ファインサイエンスツール
インスリン注射器	BD	329461	1/2 CC、低用量U-100インスリン注射器
トロカール	アメリカの革新的な研究	MP-182
カミソリ刃	フィッシャーサイエンティフィック	12〜640
クリドックス	フィッシャーサイエンティフィック	NC0089321
外科用アンダーパッド	フィッシャーサイエンティフィック	50587953	アンドウィン・サイエンティフィック・イ56616018
ベタジン消毒液	ウォルグリーン
3M Vetbond (n-ブチルシアノアクリレート)	3Mサイエンス。人生への応用