全身ピロカルピン治療:側頭葉てんかんのマウスモデル

要約

出典:Kim, J. E. and Cho, K. O. マウスの側頭葉てんかんと脳波モニタリングのピロカルピンモデル。J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオでは、モデル側頭葉てんかんにピロカルピンを全身投与することにより、マウスでてんかん重積状態(SE)を誘発する手順を紹介しています。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. SEインダクション

1. 8週齢の雄C57BL/6NHsdマウスを購入し、各マウスの体重を量ります。次に、マーカーペンを使用して、SE誘導中に簡単に識別できるように、すべてのマウスの尾に印を付けます。
2. マウスの体重に基づいて、臭化スコポラミンメチル(スコポラミン;2 mg / kg)、テルブタリン半硫酸塩(テルブタリン;2 mg / kg)、および塩酸ピロカルピン(ピロカルピン;280 mg / kg)の量を計算し、生理食塩水(0.9%NaCl、10 mL / kg)を加えて溶液を作ります
   注:例えば、マウスの体重が25 gの場合、次の量が適用されます:スコポラミンとテルブタリン:2 mg / kg *(25 g / 1,000 g)= 0.05 mg、生理食塩水:10 mL / kg *(25 g / 1,000 g)= 0.25 mL、ピロカルピン:280 mg / kg *(25 g / 1,000 g)= 7 mg、生理食塩水:10 mL / kg *(25 g / 1,000 g)= 0.25 mL。
3. スコポラミンとテルブタリンの混合物を30Gの針が付いた1mLのシリンジに入れます。溶液を各マウスに腹腔内に注入し、マウスをケージに戻します。スコポラミンとテルブタリンの投与後30分で、ピロカルピン溶液を各マウスに注入します(i.p.;1 mLシリンジ;30 G針)。ピロカルピン注射後すぐに、マウスをインキュベーター(28〜30°C)に入れて観察します。
4. SEが誘発されるまで、マウスの行動を注意深く監視します。ラシーンのスケールでステージ3以上に対応する大脳辺縁系運動発作が検出された場合は、時間を記録し、マウスを観察して発作の頻度が高いかどうかを判断してください。連続した運動発作が2分以上続いたら、マウスを室温の新しいケージに入れ、3時間監視し続けて、けいれん発作が継続し、SEが誘発されるかどうかを確認します。ピロカルピン注射の約2時間後にSEに入らなかったマウスを安楽死させます
   注:ラシーンのスケール。ステージ1、口と顔の動き。ステージ2、頭をうなずく。ステージ3、前肢クローヌス;ステージ4、前肢クローヌスでの飼育。ステージ5、前肢クローヌスで隆起して転倒します。SE導入直後にマウスを室温でケージに移さないと、マウスは温熱療法により死亡する可能性があります。
5. SE発症後3時間で行動性急性発作をジアゼパム溶液(i.p.; 10 mg / kg; 1 mLシリンジ; 30 G針)を注射して終了します。.ジアゼパム溶液は、生理食塩水(i.p.;10 mL/kg;1 mLシリンジ;30 G針)を加えて、10%ポリオキシル35水添ヒマシ油で5 mg/mLを希釈して調製します。
   注:10%ポリオキシル35硬化ヒマシ油溶液:1mLポリオキシル35硬化ヒマシ油溶液+ 9mL生理食塩水。溶液は室温で保存してください。例えば、マウスの体重が25gの場合、ジアゼパム溶液250μLを注入します:50μL 5mg/mLジアゼパム+200μL 10%ポリオキシル35水添ヒマシ油溶液=250μL 1mg/mLジアゼパム。
6. 偽マウスの場合、スコポラミン臭化メチルとテルブタリンヘミスルフェート混合物(i.p.;両方;2 mg/kg、10 mL/kg;1 mLシリンジ;30 G針)のi.p.注射を行います。30分後、生理食塩水を腹腔内に注射します(i.p.;10 mL/kg;1 mLシリンジ;30 G針).
   注:マウスの体重が25 gの場合は、ピロカルピンの代わりに250 μLの生理食塩水を注入してください。
7. ジアゼパム注射(i.p.;1 mLシリンジ;30 G針)後、個々のマウス(i.p.;1 mLシリンジ;26 G針)ごとに1 mLの5%デキストロースを投与します。.< br /> 注:1mLの5%デキストロース注射は、生存率を高めることができるエネルギー源と水分補給を提供します。
8. インキュベーター(28〜30°C)でのアフターケア中に、唾液、涙、糞便などの過剰な分泌物を拭き取ります。
9. SE導入後1日目に、マウスの体重を量り、インキュベーター(28〜30°C)に1日余分に保管します。2日目に、SE導入後、マウスの体重を量り、ホームケージに戻します。彼らの回復を促進するために湿ったチャウを提供します.
   注:この実験では、SE終了後のC57BL/6NHsdの死亡率は平均8.57%でした(試験したマウス35匹中3匹)。
10. ピロカルピン投与後7日まで動物の1日体重を測定し、体重が増加していない場合はマウスに5%デキストロース(i.p.;1 mL注射器;26 G針)を注射します。.マウスが体重を回復し始めたら、ピロカルピン注射の2日後に問題なく湿ったチャウを摂取し始めたら、体重モニタリングを中止してください。
    注:マウスの体重がSE後7日まで増加しなかった場合は、マウスを実験から除外し、二酸化炭素で安楽死させます。マウスの背景によっては、死に至ることがあります。しかし、C57BL/6NHsdの場合、これらの実験で死亡したマウスは1%未満でした。SE導入後7日以上の生存率では、潜伏期にマウスが死亡することはめったにありません。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
C57BL/6	エンビゴ	C57BL/6NHsdの
スコポラミン硝酸メチル	シグマ	S2250	10倍のストックを作る
テルブタリン半硫酸塩	シグマ	T2528	10倍のストックを作る
ピロカルピン塩酸塩	シグマ	P6503
ジアゼパム	サムジン
ひまし油(コリファーEL)	シグマ	C5135	ポリオキシル 35 水添ヒマシ油
生理食塩水	ダイハンファーム(株)
5% デキストロース	ダイハンファーム(株)
1 mL シリンジ	Sung shim medial Co., Ltd. (ソンシムメディアル株式会社)
26ゲージニードル	Sung shim medial Co., Ltd. (ソンシムメディアル株式会社)		26 G * 13 mm(1/2インチ)
30ゲージニードル	Sung shim medial Co., Ltd. (ソンシムメディアル株式会社)		30 G * 13 mm(1/2インチ)

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