腫瘍からのオルガノイドの調製:3D In Vitro腫瘍モデル

要約

出典:Wadosky, K. M., et al. 前立腺癌の遺伝子操作マウスモデルからの腫瘍オルガノイドの生成。J. Vis. Exp.(2019年)。

腫瘍由来のオルガノイドは、腫瘍の病理学的特徴と臓器特異的な細胞系統を維持できる3D細胞培養モデルの一種です。このプロトコルの例では、科学者が遺伝子操作マウスモデルから前立腺腫瘍からオルガノイドを生成する様子を見ていきます。

プロトコル

ここで説明する動物の手順は、ニューヨーク州バッファローのロズウェルパーク総合がんセンターの実験動物資源部門の施設動物管理および使用委員会(IACUC)の承認を得て行われました。

注:オルガノイドの生成のために前立腺または前立腺腫瘍を分離するために解剖される雄マウスは、少なくとも性的成熟年齢(約8〜10週齢)に達している必要があります。マウスの具体的な年齢は、研究によって異なる場合があります。年齢を選択する際に考慮すべき要素には、前立腺細胞集団の年齢依存的な変化、特定のプロモーター駆動型Cre導入遺伝子の年齢依存的な発現、特定のGEMMにおける前立腺腫瘍の進行速度などがあります。

注:図1は、腫瘍オルガノイドの生成手順を図で示しています。

1. 準備

1. Drostらに従って、以下の変更を加えてマウス前立腺オルガノイド培地を調製します。NogginおよびR-Spondinには組換えタンパク質の代わりに馴化培地を使用し、NogginおよびR-Spondin馴化培地には10%ではなく1%(v/v)の最終濃度を使用します
   注:HAマウスNoggin-FcまたはHAマウスRspo1-Fcを安定的にトランスフェクションしたHEK293細胞を用いて、それぞれNogginまたはR-Spondinにコンディショニングした培地を作製します。これらの細胞株は、スタンフォード大学のCalvin Kuo研究室から寄贈されました。
2. 20 mg/mL コラゲナーゼ II をアドバンスト DMEM/F12(+++) 培地で希釈し、最終濃度 5 mg/mL まで希釈し、15 mL チューブに消化溶液を調製します。Y-27632 Rock Inhibitorを最終濃度10 μM.
   でコラゲナーゼII溶液に添加します。 注:組織に対する消化緩衝液の比率は1 mLから50 mgで、Drostらに従って使用しています。

2. 腫瘍組織のミンチと消化

1. 細胞培養フードに、前立腺腫瘍組織を滅菌済みの10cm培養皿に入れ、壊死組織を解剖して廃棄します。
2. 残りの前立腺腫瘍組織を滅菌湾曲した鉗子で組織片を保持し、解剖ハサミで切断することにより、^1mm3キューブにミンチにします。
3. 細かく刻んだ腫瘍片を消化バッファーのある15mLチューブに入れ、鉗子の湾曲した面ですくい上げます。.腫瘍組織を37°Cで1.5〜2時間振とうしながら消化します。消化の進行状況を20分ごとに確認
   注:このとき、-20°Cで保存したマトリックスから少なくとも2mLのマトリックスを取り出し、氷上で解凍します。マトリックスの1mLアリコートは、解凍するのに約3時間かかります。
4. 組織消化後、チューブを175 x gで4°Cで5分間遠心分離し、細胞ペレットを形成します。
5. 上清を取り除き、チューブをフリックして細胞ペレットを緩め、10 μM Y-27632 Rock Inhibitorを添加した予熱したトリプシン1 mLに細胞ペレットを再懸濁します。チューブを37°Cのウォーターバスに5分間入れます。
6. インキュベーション後、標準のP1000チップで5回ピペットで上下します。チューブを37°Cのウォーターバスにさらに5分間戻し、手順2.6.
   を繰り返します 注:このとき、滅菌済みの6ウェル細胞培養皿を55°Cのインキュベーターに入れて温めます。

3. 行列内のセルのカウントと再懸濁

1. 9 mLの冷AdDMEM/F12(+++)を加えて細胞を洗浄し、チューブを175 x gで4°Cで5分間遠心分離します。
2. 遠心分離後、上清を取り除き、チューブをフリックしてペレットをほぐし、10 mLの冷たいAdDMEM / F12(+++)を加えて細胞を再度洗浄します。チューブを175 x gで4°Cで5分間遠心分離します。
3. 遠心分離後、上清を取り出し、チューブをフリックしてペレットをほぐし、細胞を1mLのAdDMEM/F12(+++)に再懸濁し、標準的な手順に従って血球計算盤で細胞数をカウントします。
4. 7〜8個のドームは、オルガノイドをドロップワイズ方式でマトリックスに播種すると、6ウェルディッシュの1ウェルに収まります。約200μLのマトリックスは、7〜8個のドームを生成します。将来の実験目的に必要なオルガノイドのウェル数を決定し、必要なマトリックスの量を計算します。次に、マトリックスの最終濃度が 1.0 x 10⁶ 細胞/mL になるために必要な細胞含有溶液の量を計算します。
5. 細胞をカウントした後、175 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を取り除き、チューブをフリックしてペレットを緩め、ステップ3.4.
   で計算したマトリックスの量で細胞を再懸濁します。 注:マトリックスは4°Cでのみ液体のままです。マトリックスストックチューブとマトリックスセル溶液は常に氷上に置いてください。

4. めっきマトリックスドームとメディアの応用

1. マトリックスセル溶液をP200ピペットと混合して、気泡を導入せずに細胞を均一に分散させます。6ウェル培養皿を55°Cインキュベーターから取り出します。
2. 200 μLのマトリックスセル溶液を慎重にピペットで取り、溶液をウェルにすばやく滴下してドームを作ります。
3. マトリックスセル溶液の量が消費されるまで、手順4.2を繰り返します。ドームを室温で2分間固化させます。
4. 6ウェルディッシュを逆さまにし、ディッシュを37°Cのインキュベーターに入れて20分間固化を続けます。
5. インキュベーション後、2 mLのマウス前立腺オルガノイド培地を各ウェルに加えます。合成アンドロゲンR1881を各ウェルに添加して最終濃度を1 nMにし、Y-27632 Rock Inhibitorを最終濃度10 μMにします。慎重に混合し、プレートを37°Cのインキュベーターに入れて培養します。
   注:オルガノイド培養培地には、オルガノイド生成後わずか1週間、10 μM Y-27632 Rock Inhibitorを添加する必要があります。

結果

図1:前立腺腫瘍オルガノイドを作製するためのプロトコルのフローチャート。前立腺腫瘍を解剖した後、組織を1mmに細かく刻みます。腫瘍片をコラゲナーゼで消化し、細胞を採取し、トリプシンで消化して単一細胞懸濁液を得ます。細胞をカウントした後、1.0 x 10⁶ cell/mLの細胞濃度に必要な量のマトリックスに再懸濁します。ドロップワイズ法を使用して皿にドームをプレートします。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.25% トリプシン+2.21 mM EDTA	シグマ	25-053
A83-01	MedChemExpressの	HY-10432
高度なDMEM/F12+++	ギブコ	12634
分析天びん	メトラー・トレド	30216623
B27 (50倍)	ギブコ	17504044
コラゲナーゼII	ギブコ	17101015
EHS肉腫マトリックス、Pathclear Lot#19814A10	Trevigen社製	国立がん研究所フレデリック国立研究所から徴収	国立がん研究所からの助成金をお持ちの方は、マトリックスを請求できます
HEPESの(1メートル)	シグマ	〒25-060
ヒト組換え上皮成長因子(EGF)	ペプロテック	AF-100-15
L-グルタミン (200 mM)	シグマ	25から005
N-アセチル-L-システイン	シグマ	A9165の
ペニシリン-ストレプトマイシン	シグマ	P4333
精密バランス	メトラー・トレド	30216561
片刃カーボンカミソリ刃	フィッシャーブランド	12〜640
Y-276632 (ロック阻害剤)	エイプエクスバイオ	A3008

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