卵巣癌の官能化ナノ粒子標的化:卵巣癌細胞による葉酸結合ナノ粒子造影剤の取り込みを促進する技術

要約

出典:Lusk, J. F. et al.光音響フローサイトメトリーを使用した卵巣がんの検出。 J. Vis. Exp. (2020年)

このビデオでは、葉酸をキャップした硫化銅ナノ粒子(CuS NP)の内部化を促進する技術を示しています。葉酸官能基化CuS NPは、多くの卵巣がん細胞で過剰発現している葉酸受容体を標的とする能力を持っています。

プロトコル

1. ナノ粒子の合成と機能化

>注意:すべての合成は、換気された化学ドラフト内で行う必要があります。

1. 合成に先立ち、約300 mLの脱イオン(DI)水を0.2 μmの滅菌フィルターでろ過します。
2. 250mLのガラス製丸底フラスコを洗剤溶液で洗浄し、DI水ですすいでください。0.0134 gのCuCl₂を100 mLの脱イオン水に加えて、1 mMの溶液を調製します。
3. 0.015 gの葉酸(FA)をCuCl₂溶液に加え、マグネチックスターバーを使用して~5分間撹拌します。
4. Na₂S·9H₂O (100 μL DI 水中 0.024 g) を 200 μL ピペットで反応混合物に約 10 秒間加えます。
   手記：Na₂S·9H₂Oを添加すると、溶液は淡黄色から暗褐色に変色します。
5. 反応液にキャップをしてオイルバスに入れ、90°Cにセットし、マグネチックスターバーで攪拌を続けます。約15分後、またはオイルバスが85−90°Cに達したら、さらに1時間反応を進めます。混合物は徐々に濃い緑色に変わります。
   手記：圧力の上昇を避けるために、反応混合物を加熱しながらシステムをベントしてください。
6. 反応容器をオイルバスから取り出し、室温で約10〜15分間短時間冷却してから、アイスバスに移します。
7. 反応混合物が20°C未満に冷却されたら、1M NaOHを使用してpHを10に調整し、残りの葉酸を溶液に溶解します。
8. FA-CuS反応混合物を30 kDaの遠心分離カラムで精製します。15 mLバッチの溶液をカラムに加え、3,082 x gで15分間遠心分離します。
9. すべての反応混合物を濃縮したら、濃縮した画分を再度結合し、30 kDa遠心分離カラムで15 mLのpH 10 NaOHと4回洗浄します。
10. 質量測定の場合は、溶液の1/3(~66 μL)を取り出し、3つのガラスバイアルに分割します。真空オーブンで一晩、40°C、~27mmHgの真空下で乾燥させます。
11. 残りの2/3の濃縮溶液を250μLのPBSに溶解し、さらに使用するまで4°Cで保存します。
12. FA-CuS NPを使用する前に、高設定のバスソニケーターで30分間超音波処理してください。

2. 卵巣がん細胞によるFA-CuS NPsの取り込み

1. FA-CuS NPとインキュベートする前に、SKOV-3細胞をT75フラスコで、10%FBSおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含む8-15 mLのフォリン酸フリーRPMI-1640培地と少なくとも24時間インキュベー
トします。
2. 0.5 mLのフォリック酸フリーRPMI-1640完全増殖培地に0.1 x 10⁶細胞/mLの密度で細胞を播種し、24ウェルプレートに播種します。
3. 翌日、細胞を400 μg/mL FA-CuS NPSと0.5 mLのフォリック酸フリーRPMI-1640完全増殖培地に2時間インキュベー
トします。
4. このインキュベーション後、0.5 mLの0.25%トリプシンとEDTAで細胞をトリプシン化します。少なくとも1 mLのフォリック酸を含まないRPMI-1640完全増殖培地を添加してトリプシンを中和し、細胞を123 x gで6分間遠心分離します。
5. 上清を除去し、細胞を2 mLのPBSに再懸濁し、123 x gで6分間遠心分離します。この洗浄ステップを2回実行して、結合していないNPを除去します。
6. 細胞を1-2 mLのPBSに2% Tween溶液で再懸濁します。
7. 血球計算盤とトリパンブルーを使用して細胞をカウントします。さらに、細胞数が多すぎる場合は、細胞を希釈します。PBS中の細胞を2% Tweenで希釈し、検出のために選択した濃度にします。
8. これで、細胞をPAFCシステムで分析する準備が整いました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.025% トリプシンと EDTA	コーニング	25-053-CL
Amicon Ultra-15遠心フィルター	ミリポア	UFC903024
Amicon Ultra-4遠心フィルター	ミリポア	UFC803024
Bright-Line血球計算盤	ハウサーサイエンティフィック	1492
塩化銅(II)	アクロスオーガニックス	206532500
CPXシリーズデジタル超音波洗浄バス	フィッシャーブランド	モデルCPX3800
Norm-Ject 10 mL シリンジ	ヘンケサスオオカミ	4100-X00V0
FBSの	シグマ・アルドリッチ	F2442-500ミリリットル
葉酸	シグマ・アルドリッチ	F7876-10G
PBSの	アルファ・アエサル	J62036
ペニシリンストレプトマイシン	ギブコ	15140-122
RPMI Midum 1640 (1x) 葉酸フリー	ギブコ	〒27016-021
SKOV-3 セル	ATCCの	HTB-77
水酸化ナトリウムビーズ	BDHの	BDH9292-500G
硫化ナトリウム非水和物	シグマ・アルドリッチ	431648から50G
トリパンブルー溶液0.4%	アムレスコ	K940-100ミリリットル
0.2 μm 滅菌シリンジフィルター	VWRの	28145-477
アルコノックス	シグマ・アルドリッチ	242985から1.8キロ	ガラス製品の洗浄に使用される洗剤。
トゥイーン 20	シグマ・アルドリッチ	P7949-100ミリリットル

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