$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。
1. ヒト卵巣癌組織からのミトコンドリアの調製
このプロトコルには、
卵巣癌組織(n = 7)を含む卵巣組織サンプルを使用しました。
- 210 mMマンニトール、70 mMスクロース、100 mM塩化カリウム(KCl)、50 mM Tris-HCl、1 mMジアミン四酢酸(EDTA)、0.1 mMエチレングリコールビス(2-アミノエチルエーテル)四酢酸(EGTA)、1 mMフェニルメタンスルホニルフッ化物(PMSF)プロテアーゼ阻害剤、2 mMオルトバナジン酸ナトリウム(V)、および0.2%ウシ血清アルブミン(BSA)を混合して、250 mLのミトコンドリア単離バッファーを調製します。 pH 7.4です。
- 清潔なガラス皿に~1.5gの卵巣がん組織を入れます。
- 予め冷却したミトコンドリア分離バッファー2mLを加えて、組織表面から血液を3回軽く洗い流します。
- 清潔な眼科用ハサミで組織を約1mm3個に完全にミンチにし、ミンチした組織を50mLの遠心チューブに移します。
- 0.2 mg/mL のナガルスを含む 13.5 mL のミトコンドリア単離バッファーを添加し、電気ホモジナイザーを使用して、ミンチ組織を均質化します(スケール 2、10 秒 6x、間隔 10 秒を使用)(2 分、4 °C)。
- さらに3 mLのミトコンドリア分離バッファーを組織ホモジネートに加え、ピペッティングでよく混合します。
- 調製した組織ホモジネート(1,300 x g、10分、4°C)を遠心分離します。粗核画分(ペレット)を取り除き、上清を保持します。
- 上清を再遠心分離します(10,000 x g、10分、4°C)。ミクロソーム(すなわち、上清)を取り除き、ペレットを保持します。
- 2 mLのミトコンドリア分離バッファーを加え、軽いピペッティングでペレットをウェルに再懸濁します。
- ペレット懸濁液(7,000 x g、10分、4°C)を遠心分離します。上清を捨て、粗いミトコンドリア(つまり、ペレット)を保持します。
- 12 mLの25%密度グラジエント培地(すなわち、Nycodenz)を加えて、抽出した粗ミトコンドリアを再懸濁します。
- チューブの下から上に5 mLの34%、8 mLの30%、12 mLの25%(ステップ1.11の粗ミトコンドリアを含む)、8 mLの23%、3 mLの20%密度グラジエント培地をチューブに充填して不連続な密度勾配を作成し、遠心分離します(52,000 x g、90分、4°C)。
- 長くて鈍いシリンジを使用して、25%と30%の密度勾配培地の間の界面で精製されたミトコンドリアをきれいなチューブに集めます。
- 採取したミトコンドリアにミトコンドリア単離バッファーを添加し、3倍に希釈します。遠心分離(15,000 x g、20分、4°C)し、上清を捨てます。
- 2 mLのミトコンドリア分離バッファーを添加してペレットを再懸濁し、遠心分離します(15,000 x g、20分、4°C)。上清を捨て、ペレットを保管します。
- 最終的なペレット(すなわち、精製されたミトコンドリア)を収集し、-20°Cで保存します
手記：卵巣がん組織から精製されたすべてのミトコンドリアをミトコンドリアサンプルとして組み合わせ、定量的プロテオミクス分析を行います。