転移性子宮内膜がんモデルのモデリング:ウサギモデルにおけるリンパ節転移を伴う子宮内膜がんの作製手法

要約

出典:Lauren Philp et al.In vivoで増殖および培養したVX2細胞から作られた後腹膜リンパ節腫脹を伴う同所性子宮内膜がんモデル。J. Vis. Exp. (2019年度)

このビデオは、ウサギの縫合された子宮角に転移性の高いVX2細胞懸濁液を注入することにより、子宮内膜がんのウサギモデルの生成を示しています。これにより、後腹膜リンパ節転移を伴う原発性子宮内膜がんが発生します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. in vitro VX2細胞株の作製

1. ウサギの大腿四頭筋からVX2腫瘍を採取し、マウスの脇腹で成長させます。
   1. 凍結したVX2腫瘍ブロック(1 cm x 1 cm)を解凍し、メスの刃を使用して培養プレートでミンチにし、少量のHanks Balanced Salt Solution(HBSS)を順次加えて70 μmフィルターで濾し、すべての細胞が最終容量1 mLになるように濾します。
   2. 細胞をカウントし、0.9%リン酸緩衝生理食塩水で1 x 10⁷/mLの濃度に希釈し、滅菌チューブ内の氷上に置きます
      手記：腫瘍ブロックは、ウサギ大腿四頭筋におけるVX2腫瘍の以前の増殖から研究室の共同研究者から取得されました。
   3. 雌の白いニュージーランドウサギ(体重2.5〜3.5 kg)に2〜5%の吸入イソフルランを麻酔し、注射部位を覆う毛皮を取り除き、注射部位をポビドンヨード溶液で洗浄します。調製したVX2細胞懸濁液500 μL(5 x 10⁶細胞/mL)をウサギの大腿四頭筋に注入します。ウサギを臨床的に監視し、10日目から始まる腫瘍の成長を確認します。
   4. 腫瘍が直径1〜1.5 cmに達した後(キャリパーで外部から測定)、獣医師が承認した方法を使用してウサギを安楽死させます。心拍数や呼吸数などのバイタルサインを確認して安楽死を確認します。ベタジン溶液でその領域を洗浄した後、滅菌器具を使用して腫瘍を切除します。
   5. 滅菌器具を使用した生物学的安全キャビネットで、メスの刃を使用して10cmの組織培養皿で腫瘍を小片(0.2cm)に刻みます。ステップ1.1.1で説明したように、1 mLのHBSSを使用して腫瘍断片を70 μmのセルストレーナーに通します。細胞をカウントし、0.9%生理食塩水を使用して希釈し、200 μL中に7.5 x 10⁵細胞を得ます。
   6. 雄のNOD SCIDガンママウス(体重25g)に4%イソフルランを1 L / minで麻酔し、2%イソフルランを使用して麻酔を維持します。マウスに麻酔をかけたら、ステップ1.1.5の溶液200μLを27ゲージの針を使用してマウス脇腹の皮下組織に注入します。
2. in vitroでのVX2細胞の回収と継代
   1. ノギスを使用して、腫瘍が直径 1 cm に達するまで、週 2 回、異種移植片の成長を臨床的に監視します。
   2. CO₂チャンバーに入れるか、4%イソフルランガスで麻酔した後に子宮頸部脱臼を行うことにより、マウスを安楽死させます。生物学的安全キャビネット内の無菌条件下で腫瘍を切除します。
   3. 3 mLのDulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)/Ham'ss F12 + 10%ウシ胎児血清(FBS)培地を含む6 cmの組織培養皿にメスで1〜2 mmの小片に腫瘍をミンチします。
   4. 腫瘍片から細胞が増殖し始めるまで、5% CO₂ を含む 37 °C インキュベーターで腫瘍断片を 2 日間放置します。その後、培養プレートを毎日光学顕微鏡でチェックし、細胞の密度を確認します。70%の密度に達したら、0.05%トリプシン1 mLをフラスコに加え、37°Cインキュベーターに5分間戻して細胞をトリプシン化します。
   5. 6 mLのDMEM/Ham'ss F12 + 10% FBS培地でトリプシンを中和し、細胞を回収し、4°Cで300 x gで5分間遠心分離します。上清を取り除き、ペレットを新しいDMEM/Ham'ss F12 + 10% FBS培地3.5 mLに再懸濁します。新鮮な6cmコラーゲンIコーティングプレートに1.6 x 10⁶細胞/プレートを播種し、約50%の細胞播種密度を達成します
      注:50%セル密度とは、取り付け時にプレートの表面積の50%を占めるセルを指します。
   6. 早期継代:細胞が5回継代されるまで上記のプロセス(トリプシン処理、播種)を繰り返し、次に定量的PCRアッセイを使用してPCRで細胞株の純度を評価し、ウサギゲノムDNAとマウスゲノムDNAを区別します(ステップ1.3.1-1.3.4を参照)
      手記：8回の継代後、非コラーゲンコーティングされた通常の接着組織培養プレート上で細胞を増殖させることができます。
   7. DMEM/HAM F12+30% FBS+10%DMSO中の細胞のアリコートをバイアルあたり2 x 10⁶の濃度で継代、トリプシン化、凍結します。実験に必要になるまで、細胞を液体窒素で保存します。
3. 生存細胞のVX2起源の確認:
   1. 精製したマウスおよびウサギのゲノムDNAから標準治療法を作成します(ステップ1.3.2およびステップ1.3.3)。LINE-1レトロトランスポゾンエレメントの2番目のオープンリーディングフレーム内の種特異的配列を標的とするプライマーを使用してください.
      手記：CRPV E6のプライマー配列は、5's-GATCCTGGACCCAACCAGTGおよび5's-CCTGCCGGTCCCTGATTTATです。LINE-1レトロトランスポゾンエレメントを使用しました。ウサギLINE-1のプライマー配列は、5's-TCAGGAAACCCCAGAAAGTATGCおよび5's-TTTGATTTCTTGAATGACCCAGTGT マウスLINE-1のプライマー配列は、5's-AATGGAAAGCCAACATTCGTGおよび5's-CCTTCCTTGACCAAGGTATCATTGです
   。
   2. CRPV E6の標準曲線を作成するには、メーカーのプロトコルに従って市販のキットを使用してVX2腫瘍細胞ライセートを精製します(ステップ1.1.1)。市販のアッセイを使用してこのDNAを定量します。低EDTA-TEバッファーで225 pg/μLから0.925 pg/μLまでの6回の段階希釈を行います。マウスゲノムDNAの標準曲線を作成するには、市販のマウスゲノムDNA100 μgを低EDTA-TEバッファーで125 pg/μLから0.0125 pg/μLまでの5希釈液で希釈します。
   3. ステップ1.3.2のサンプルから希釈した各溶液から4 μLをウェルに入れ、PCRサーモサイクラーでサンプルを分析します。各分析のCq値とウェルあたりのDNA量を使用して、サーモサイクラーソフトウェアの自動しきい値設定を使用して標準曲線を計算します。
   4. 標準的なqPCR手順を使用して、サーモサイクラーで40サイクルの2ステップサイクリング(98°Cおよび60°C)でPCRを実行します。閾値を設定し、デルタCt値を>35に設定して、ウサギVX2細胞株のマウス汚染が最小限に抑えられるようにします。各反応の総容量は 10 μL で、5 μL の 2x Mastermix 、1 μL のフォワード + リバースプライマー (最終プライマー濃度が 250 nM の反応)、および 4 μL の DNA サンプルで構成されていました
      手記：閾値を設定し、デルタCt値を>35に設定して、ウサギVX2細胞株のマウス汚染を最小限に抑えます。qPCRによる信頼性の高い検出のためのVX2 DNAの推奨レベルは1〜10 pgです。

2. VX2細胞の培養と細胞懸濁液の作製

1. VX2細胞を含むバイアル(ステップ1.2.7で凍結)を37°Cの水浴で1分間解凍し、10 mLの培地(1:1 DMEM/F-12 + 10% FBSおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシン)を入れた円錐形遠心チューブに細胞を移します。107 x gで8分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞ペレットを9 mLの培地に再懸濁します。
2. 再懸濁した細胞を大きな培養フラスコに移します。37°Cで振とうせずに細胞をインキュベートし、光学顕微鏡を使用して細胞のコンフルエンスを毎日チェックし、3日ごとに培地を交換します。
3. 注入用培養VX2細胞懸濁液の作製
   1. 細胞が80%のコンフルエンスに達したら、3mLの0.25%トリプシンをフラスコに追加して細胞をトリプシン化します。フラスコをインキュベーター(37°C)に5分間置きます。溶液を円錐形の遠心チューブに移し、107 x gで8分間遠心分離し、上清を除去します。
   2. 細胞ペレットを9mLのリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄し、遠心分離して上記のように上清を除去します。細胞をカウントし、0.9%リン酸緩衝生理食塩水で4 x 10⁷細胞/mLの濃度に希釈し、氷上の滅菌円錐形遠心チューブに入れます。
4. in vivo増殖したVX2細胞懸濁液の創製
   1. 凍結したVX2腫瘍ブロック(1 cm x 1 cm)を解凍し、メスの刃を使用して培養プレートでミンチにし、ステップ1.1.1のように70 μmフィルターで濾します。少量のHBSSを順次添加して、すべての細胞が最終容量1 mLになるまで濾過されるようにします。細胞をカウントし、0.9%リン酸緩衝生理食塩水で1 x10⁷/mLの濃度に希釈し、滅菌チューブ内の氷上に置きます
      手記：腫瘍ブロックは、ウサギ大腿四頭筋におけるVX2腫瘍の以前の増殖から研究室の共同研究者から取得されました。

>3. 手術モデルの構築

1. 外科的麻酔の確立と術前準備
   1. アセプロマジン (1 mg/kg IM) とメロキシカム (0.2 mg/kg SQ) の注射を使用して、計画された外科的処置の 1 時間前に、雌の白ニュージーランドウサギ (2.5-3.5 kg) を前投薬します。雌の白ニュージーランドウサギ (体重 2.5-3.5 kg) に 2-5% 吸入イソフルランを含ませ、注射部位を覆う毛皮を取り除き、注射部位をポビドンヨード溶液で洗浄します。
   2. 麻酔をかけたウサギに喉頭マスク気道 (LMA) を使用して挿管し、テープで所定の位置に固定し、吸入イソフルラン用量を 2 〜 5% 滴定して深い麻酔を維持します。バイタルサイン(呼吸数、毛細血管の補充、利用可能な場合は酸素飽和度)をチェックし、痛みを示唆する兆候(動き、刺激からの離脱、ノイズ)または軽い麻酔(動き、LMAチューブを噛む)を監視することにより、手順全体を通して外科的麻酔を定期的に監視します。
      手記：これは、外科的麻酔のモニタリング経験を持つ人が行う必要があります。
   3. 22ゲージの耳静脈カテーテルを辺縁背静脈に留置します。セファゾリン(20 mg / kg)を外科的皮膚切開の10分前に静脈内投与します。.
   4. ウサギを手術台に置く前に骨盤と腹部に毛をクリップし、ウサギを手術台の背側に置きます。3ステップの外科的皮膚調製(ベタジン石鹸、クロルヘキシジン溶液、ベタジン溶液)を使用して手術野を洗浄します。恥骨の上部にランドマーキングを施した後、開腹術で手術野をドレープし、下腹部の5cm×5cmの領域を露出させます。
2. 開腹切開の作成と子宮角の同定
   1. サージカルキャップとフェイスマスクを着用します。クロルヘキシジンまたはベタジン外科用スクラブ溶液を使用して手をこすります。.滅菌技術を使用して、滅菌ガウンと滅菌手術用手袋を着用します。
   2. #11ブレードメスを使用して、ウサギ腹部の皮膚と皮下組織を通して恥骨結合に2.5cmの長さの頭蓋骨を1cm切開します。直腸筋膜を切開し、直腸筋を横方向に解剖して、下にある腹膜を露出させます。下面に腸や他の腹部臓器がないことを確認した後、腹膜に鋭く入ります。
   3. 子宮角の位置を特定し、膀胱を特定し、手袋をはめた指を膀胱の頂点の上、後方、横方向に掃きます。
      手記：必要に応じて、デジタル圧力を使用して膀胱全体を空にすることができます。位置を特定したら、子宮角を腹部切開部に通して腹壁に置きます。
   4. 3-0編組吸収性縫合糸を使用して、子宮頸部から約1.5〜2.0cm遠位の各子宮角の単一の縫合糸結紮を行います。縫合糸を、各角の外側に沿って走る子宮動脈のすぐ内側に配置します。縫合糸をぴったりと結び、遠位の子宮角を閉塞します(図1)。
3. 子宮筋層VX2接種
   1. 27ゲージの針を使用して、ステップ2.3.2(培養VX2モデルの場合)または2.4(in vivo伝播VX2モデルの場合)のいずれかから、事前に調製したVX2細胞懸濁液0.5mLを、縫合部位に近接する各子宮角の子宮角(縫合部位と子宮頸部の間)の子宮角に注入します。1分以上注射し、細胞が下にある子宮腔に注入されていないことを確認します。 吸入イソフルラン(2〜5%)とベイン回路を備えた麻酔器を使用して動物に麻酔をかけます。
   2. 細胞の漏出を最小限に抑えるために、注射後30秒間子宮筋層注射部位に圧力をかけます。注射部位と縫合部位の止血を検査し、子宮角を腹部に戻します。
4. 外科的切開を閉じる
   1. 深い腹壁の閉鎖:腹膜切開の頂点を特定し、組織鉗子で腹膜、直腸筋、筋膜をつかみます。
      1. これを行うには、切開部の片側を表側から深部に縫合し、反対側を深部から表層に縫合することにより、縫合糸を切開部の一方の頂点に固定します。結び目を作ります。付属の縫合糸を使用して、腹壁の層を通して切開部に対して垂直にランニングステッチを行い、切開部に沿って左右に段階的に作業します。縫合糸を結び、カットします。
   2. 表在性腹壁閉鎖: 皮膚切開部の頂点を特定し、埋設ランニング皮下 3-0 吸収性ポリフィラメント縫合糸を使用して腹部皮膚を縫合します。閉じた切開部に外科用接着剤を塗布して、皮膚の縁に対抗します。
      1. これを行うには、切開部の片側を深部から表層に縫合し、反対側を表層から深部に縫合することにより、切開部の一方の頂点に縫合糸を固定します。結び目を作ります。付属の縫合糸を使用して、切開部と平行な真皮層のランニングステッチを切開部に沿って左右に段階的に動かします。縫合糸を結び、カットします。
5. 術後ケア
   1. 麻酔からの覚醒:切開部が閉じたらイソフルランをオフにし、うさぎにマスクで酸素を吸わせながら、覚醒の兆候を監視します(例:.、自発的な動き、喉頭マスク気道の咀嚼運動)。これらの兆候が認められたらウサギを抜管し、ウサギが警戒して自立できるようになるまで、マスクと暖かい毛布で酸素を供給します。
   2. 術後のモニタリング: ウサギを 1 日 2 回 4 日間、術後さらに 10 日間毎日監視します。彼らの全身状態、食物と水の摂取量、尿と糞便の排出量、痛みの評価、体重、バイタルサイン(心拍数、呼吸数)、および腫れ、紅斑、分泌物、または裂開を探す手術部位を監視、評価します。
   3. 術後の疼痛管理:メロキシカムを術後48時間毎日(0.2 mg / kg SQ)投与し、その後、痛みの評価に基づいて必要に応じて投与します。ブプレノルフィンを術後すぐに投与し、12時間ごと(0.01-0.05 mg / kg SQ)を24時間投与し、その後、痛みの評価に基づいて必要に応じて
   投与します
   4. 抗生物質(エンロフロキサシン5mg/kg IM)は、獣医師の推奨通り、創傷感染を防ぐために術後7日間毎日投与することができます。脱水症のために1日2回皮下液(15mLのSQ)を投与し、減量のために必要に応じて柔らかい食品やその他の栄養補助食品を毎日提供します。

結果

図1:子宮縫合。 黒い矢印=縫合糸、赤い矢印=子宮の角。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
11枚刃メス、滅菌、使い捨て	アスペンサージカル(VWR)	〒80094-086
22-gague耳静脈カテーテル	CDMVの	14332
3-0吸収性ポリフィラメント縫合糸(Polysorb)	コヴィディエン	356718
3-0 編組吸収性縫合糸 (Polysorb)	コヴィディエン	356718
70uMセルストレーナー、個別包装、ナイロン	隼	352350
アセプロマジン(アトラベット)	CDMVの	1047
ベタジン石鹸(ポビオドンヨウ素7.5%)	CDMVの	4363
ベタジン溶液(ポビオドンヨウ素10%)	UHNストア	457955
ブプレノルフィン	マギル大学
セファゾリン	UHN入院薬局	猫はいらない#必要な
クロルヘキシジン溶液	CDMVの	119872
Corning BioCoatセルウェア、コラーゲンI.型、100mm皿	コーニング	354450	ブランドは重要ではありません
Corning BioCoatセルウェア、コラーゲンI型、24ウェルプレート	コーニング	354408	ブランドは重要ではありません
Corning BioCoatセルウェア、コラーゲンI型、6ウェルプレート	コーニング	354400	ブランドは重要ではありません
Corning Matrigel 基底膜マトリックス、*LDEVフリー、10 mL	コーニング	354234
DMEM/ハムF12 1:1	ライフテクノロジー	11320	ブランドは重要ではありません
DMSOの	カレドンラボ化学	4100/10/01
エンロフロキサシン(バイトリル注射剤)	CDMVの	11242
ファルコンチューブ	コーニング Centri-Star	430828
ウシ胎児血清、認定、カナダ産、500ml	ライフテクノロジー	12483020	ブランド/ソースは重要ではありません
イソフルラン	UHN入院薬局	猫はいらない#必要な
イソヘキソールコントラスト	GEヘルスケア	407141210
メロキシカム(メタカム0.5%)	CDMVの	104674
通常の生理食塩水	ハウスブランド(UofT Medstore)	1011
PBSの	マルチセルまたはシグマ	331-010-CLまたはD8537-500mL
ペニシリン/ストレプトマイシン(100mL、10000Uペニシリン、10000ugストレプトマイシン)	コーニングセルグロ	CA45000-652
滅菌ハンクスバランス塩溶液(-Ca++、-mg++、-フェノールレッド)	T.C.M.F(ドクター・ブリストウ)	11-1-28
サージカルグルー(ティッシュ接着剤)	3Mベトボンド	14695Bさん
トリプシン(0.25%)、プロテオミクスグレード	シグマ	T-6567-5X20UG
トリプシンEDTA、0.05%、100ml	Wisent株式会社	325-542-EL	ブランドは重要ではありません

名 名 い い 年