イメージング質量分析のための卵巣がんコミュニケーションのモデリング:転移性卵巣腫瘍の発生における低分子化学コミュニケーターを同定する方法

要約

出典: Zink, K. E. et al. Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (2019)

このプロトコルは、卵巣外植片を卵管がん細胞と共培養することによるサンプル調製の技術について説明しています。これらのサンプルは、イメージング質量分析法(IMS)を使用して視覚化され、腫瘍の発生につながる細胞と組織間の小分子交換を検出します。

プロトコル

動物が関わるすべての手続きは、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 共培養のためのITO処理スライドのセットアップとインキュベート

1. 分割されていない共培養
   1. ホットプレート上でアガロースを70°Cで液化します。
   2. 8ウェルディバイダーを、インジウムチノキシド(ITO)処理スライドの上に置きます(図1A)。仕切りのゴム底はスライドへの接着を助けますが、アガロースめっき中は、ウェル間の漏れや混合を防ぐために、連続して穏やかな下向きの圧力を加えるようにしてください。
   3. 15 mLのコニカルチューブで細胞を採取し、遠心分離(800 rpmで5分間)し、1x DMEM培地で150 μLあたり50 k細胞に再懸濁します。異なる細胞密度が最適である場合は、このステップで細胞懸濁液が目的の最終密度の2倍であることを確認してください(たとえば、300 μL中に50,000個の細胞を最終濃度にすると、このステップでの細胞密度は150 μL中に50,000個の細胞になります)。
   4. 細胞培養をプレーティングする前に、ウェルの中央に卵巣外植片を添加します(図1B)。
   5. プレーティングの直前に、個々の2 mLチューブで各細胞培養にアガロースを添加します。各ウェルについて、200 μLの細胞懸濁液と200 μLの液化アガロースを2 mLチューブに入れます。例えば、4つのウェルの場合、800 μLの細胞懸濁液と800 μLの2%アガロースを組み合わせます。多少の混合物が残りますが、必要以上に多めに作ることで、ピペッティング中の気泡を防ぐことができます。
      1. その細胞培養物をプレーティングする直前に、個々の細胞培養物にアガロースを添加します。アガロースは1分以内に冷えるので、すぐに盛り付ける準備をしてください。
   6. 直ちに300 μLの細胞/アガロース混合物を各ウェルに加えます(図1C)。図1Cは、3つの細胞条件と1つの培地条件を示しており、それぞれが卵巣の有無にかかわらずプレーティングされています。
   7. スライドを37°Cおよび5%CO₂で加湿インキュベーターでインキュベートします。
2. 分断された共文化
   1. 薄くて滑らかなプラスチックから仕切りを切ります(図2A).
      手記：この実験では、平らで薄いため、滅菌済みの使い捨て培地洗面器の側面を使用します。井戸の斜辺にぴったりと収まるように幅を広く切ります (~13 mm)。
   2. ホットプレート上でアガロースを70°Cで液化します。
   3. 8ウェルディバイダーをITO処理したスライドの上に置きます(図2B)。仕切りのゴム底はスライドへの接着を助けますが、アガロースめっき中は、ウェル間の漏れや混合を防ぐために、連続して穏やかな下向きの圧力を加えるようにしてください。

2.スライドの乾燥とMALDI-TOF MSの準備

1. 4日後(または任意の時点)後、アガロースプラグとスライドからチャンバーディバイダーを取り外します(図1D)。平らなヘラでアガロースの側面をチャンバーからそっと取り外し、アガロースのプラグを動かさないように注意しながら、チャンバーをゆっくりと上に引っ張ります。それらが動く場合は、互いに触れ合わないようにゆっくりと位置を変えます。
2. スライドを37°Cのオーブンに約4時間置き、1時間ごとに90°回転させます
   手記： スライドの回転は、サンプル全体に均一な熱分布を確保するために重要です。
3. 乾いたら、スライドをオーブンから取り出します(図1E)。
4. 噴霧器(図1F)を使用して、温度= 30°C、流速= 0.2 mL / min、パス回数= 8、方向= CC、ノズル距離= 40 mm.
   でマトリックス溶液を塗布します。 手記：マトリックス噴霧器の代わりに、芸術的なエアブラシを使用して液体マトリックスを塗布できます。同じマトリックス溶液を使用してスプレーすることもできますが、約2倍の溶液が必要です。スライドを垂直に吊るすようにクランプした状態で、マトリックス層が見えるまで、約1フィート離れた90°の角度からスライドにスプレーします。
5. 1 μL のキャリブラント (ターゲット<500 Daの場合はリンレッド)、ターゲット<5,000 Daの場合はペプチド混合物(材料表を参照)を添加して、スライド上のスポットを空けます。Phosphorus Redはマトリックスとの混合を必要としませんが、ペプチド混合物はイオン化を助けるためにマトリックスと1:1の混合物を必要とします。キャリブラントが乾くのを待ちます。
6. スライドの各角に油性マーカーを使用してXを描き、カメラまたはスキャナーを使用して1,200dpiの光学画像を撮影します。

結果

図1:未分割共培養のサンプル調製のワークフロー。 (A)ITOコーティングされたスライドの導電面に8ウェルチャンバーを接着します。(B)共培養条件のために、半分にした卵巣を井戸の中央に置きます。(C)300μLのアガロース/細胞懸濁液をウェルに直接加えます。気泡がないこと、および卵巣がウェルの中央に残っていることを確認してください。ピペッティングしたアガロースが卵巣を乱した場合は、アガロースが冷える前にピペットの先端をそっと使用して卵巣を中央に配置します。(D)4日間のインキュベーション後(または最適化された時間)、8ウェルチャンバーをスライドから取り出します。アガロースがチャンバーに付着したままの場合は、へらを使用してアガロース...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
デンビル	C1017-O	細胞を収集するには
ミリポア	PEZGS0816	Millipore Millicell から再利用 EZスライドチャンバースライド
シグマ・アルドリッチ	34998から4L	溶射マトリックス用溶媒
エッペンドルフ	5810 R	セルを収集して削除するには 上澄み
ブルカー・ダルトニック	8201344	乾燥したスライドにマトリックスをスプレー
ブルカー・ダルトニック	8201346	乾燥したスライドにマトリックスをスプレー
ギブコ	11995年065月	アガロース混合培地
ジェネシー・サイエンティフィック	22から282	アガロースアリコート用
ブルカー	8237001	共培養インキュベーションのためのプラットフォーム
シグマ・アルドリッチ	A9414-10Gの	めっき用培地と混合
コーニング	4870	プラスチック仕切りの切断に使用されます 分割されたチャンバー
ブルカー・ダルトニック	8206195	中質量範囲用キャリブラント
シグマ・アルドリッチ	343-242-5G	低質量範囲用キャリブラント
シムガ・アルドリッチ	E2758	細胞培養培地サプリメント
ペプロテック株式会社	100から15	細胞培養培地サプリメント
セルグロ	30-005-CR	細胞培養培地サプリメント
シグマ・アルドリッチ	11074547001	細胞培養培地サプリメント
ギブコ	〒25030-081	細胞培養培地サプリメント
ギブコ	15140-122	細胞培養培地サプリメント
フィッシャーテクノロジーズ	A116-50	マトリックスソリューションに追加されました
HTXテクノロジー		マトリクスの適用用

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