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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 金ナノスターコア合成
>注:金ナノスターは、この実験で使用されるSERRSナノプローブの両方のフレーバーのコアとして使用されます。
- 脱イオン(DI)水に800 mLの60 mMアスコルビン酸(C6H8O6)溶液を調製し、DI水に8 mLの20 mMテトラクロロオーリン酸(HAuCl4)溶液を調製します。4°Cに冷却します。
- この反応ステップを4°Cで行い、アスコルビン酸溶液800mLの入った円錐形フラスコをマグネチックスタープレート上に置き、定常な渦を誘導します。8 mLのテトラクロロオーリン酸溶液を渦にすばやく加えます。数秒以内にナノスターが形成され、溶液は濃い青色を帯びます。任意の時点で色がピンクまたは紫になり、ナノスフェアの形成を意味する場合は、懸濁液を廃棄し、合成を再試行する必要があります。
- nanostar懸濁液を50 mLのコニカルチューブに注ぎ、20分間(4°C、3,220 x g)遠心分離します。上清を吸引し、各チューブに約200μLの溶液を残します。チューブの底にあるナノ粒子のペレットを乱さないように注意してください.
手記： 上清は、浮遊しているナノスターが残っているため、青みがかっている必要があります。
- マイクロピペットを使用して溶液を撹拌し、各チューブからナノ粒子を懸濁して回収します。ペレットの一部はチューブの底で圧縮され、激しいピペッティングを行っても再懸濁しない場合がありますので、この部分は廃棄してください。
- ナノ粒子懸濁液を透析カセット(MWCO 3.5 kDa)に移し、2 Lの脱イオン水に対して少なくとも3日間透析し、毎日水を交換します。ナノスターは、3〜4日ごとに水を交換しながら、4°Cで最大1ヶ月間透析液に保存します
手記：ナノスターは、セクション2で説明したように、ケイ化反応に必要になるまで透析状態に保つ必要があります。
2. シリカシェルの形成
>注:ラマンナノプローブには2種類の種類があります。合成手順はどちらも同じですが、唯一の違いは使用するラマンレポーター分子(色素)です。この実験では、過塩素酸IR780とIR140を使用します。反応は常にプラスチック容器で行う必要があります。合成は非常にスケーラブルで、必要な注入液の量に合わせて調整できます。ここでは、ミディアムバッチ合成について説明し、必要に応じて、同じ濃度と反応時間で、少量または高容量に直線的にスケーリングできます。2種類のSERRSナノプローブの反応は、並行して行うことができます。クロスコンタミネーションを避けるために注意してください。超音波処理は、遠心分離後のナノ粒子ペレットの再分散、洗浄工程中、またはナノ粒子を1時間以上保存した後に行うべきである。超音波処理は、ナノ粒子が溶液中に明確に懸濁されるまで、通常は1秒間実施すべきである。
- チューブA(50 mLコニカルチューブ)で、10 mLのイソプロパノール、500 μLのTEOS、200 μLの脱イオン水、および60 μLの染料(IR780過塩素酸塩またはIR140、20 mMのDMF(ジメチルホルムアミド))を混合します。.
- チューブB(15 mLのコニカルチューブ)に、3 mLのエタノールと200 μLの水酸化アンモニウムを混合します。ステップ1.4からナノスターを超音波処理して溶液中の任意のクラスターを分散させ、チューブに1.2mLのナノスターを加えます
注:水酸化アンモニウム溶液は揮発性が高く、正確にピペットで切るのが困難です。ピペッティングを容易にするために、必要になるまで4°Cで保存してください。
- チューブAをボルテックスミキサーに置き、安定したボルテックスを誘導します。チューブBの内容物を渦に素早く加え、約5秒間混合を続けます。すぐにシェーカーに移し、室温で300rpmで振とうしながら15分間反応させます。
- 15分間のインキュベーション後、エタノールを加えて50 mLチューブを満たして反応を急冷します。3,220 x g、4°Cで20分間遠心分離します。
- ペレットを乱さないように注意しながら、約0.5mLの溶液を残して上清を吸引します。1mLのエタノールを加え、ピペットで撹拌してナノ粒子を再懸濁します。1.5mLの遠心チューブに移し、11,000 x gで4分間遠心分離し、上清を吸引し、ペレットを約1秒間超音波処理してペレットを再懸濁することにより、エタノールで4回洗浄します。
- 注:この段階では、セクション3に記載されているように、ケイ化ナノ粒子を官能基化するか、追加の洗浄ステップで脱イオン水に再懸濁して、4°Cで最大1週間保存することができます。
>3. 表面機能化
注:IR780 SERRSナノプローブは、PEG架橋剤を介して葉酸受容体標的抗体と結合し、αFR-NPを形成します。IR140 SERRS制御ナノプローブは、nt-NP用の不動態化PEG単分子膜と結合されます。どちらのフレーバーも、チオール-マレイミド反応が別々に並行して反応することで形成されます。
- ナノ粒子を11,000×gで4分間遠心分離し、上清を吸引し、超音波処理によりペレットを1mLのエタノールに再懸濁することにより、ナノ粒子を2回洗浄します。洗浄ステップをもう一度繰り返しますが、85%エタノール、10%3-MPTMS(3-メルカプトプロピルトリメトキシシラン)、および5%脱イオン水1mLに再分散します。室温で1〜2時間インキュベートし、粒子表面にチオールを導入します。
- チオール官能化ナノ粒子を11,000×gで4分間遠心分離し、上清を吸引し、超音波処理によりペレットを再懸濁し、エタノールで2回、DIで2回、最後にHEPES(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)緩衝液(10mM、pH 7.1)で洗浄し、取っておきます。
- 注:MES(2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸)緩衝液またはHEPESを使用する必要があります。PBS(リン酸緩衝生理食塩水)などの塩分濃度の高い緩衝液は、ナノ粒子の凝集を誘導する可能性があります。
- 抗体修飾αFR-NPについては、200 μgの抗体(抗葉酸結合タンパク質抗体クローン[LK26])を、10倍モル過剰のPEG架橋剤(ポリ(エチレングリコール)(N-ヒドロキシスクシンイミド5-ペンタン酸)エーテルN'-(3-マレイミドプロピオニル)アミノエタン(CAS:851040-94-3)をジメチルスルホキシド(DMSO))500 μLのMESバッファー(10 mM、pH 7.1)で30分間反応させます。
- 遠心フィルター(MWCO 100 kDa)で抗体-PEG溶液を遠心分離することにより、余分な架橋剤と濃縮抗体を除去します。この研究で使用した遠心フィルターについて、14,000 x g、23°Cで10分間遠心分離を行い、フィルターを反転させ、1,000 x gで2分間遠心分離することにより、新しいチューブで標識抗体を回収します。
- ステップ3.2のIR780ナノ粒子を抗体の入ったチューブにピペットで移し、ピペットで攪拌して混合します。混合物を室温で少なくとも30分間、または4°Cで一晩インキュベートして、αFR-NPを形成します。
- nt-NPを形成するには、ステップ3.2のIR140 SERRSナノ粒子にDMSOに溶解した1% w/vメトキシ末端(m)PEG5000-マレイミド(CAS:99126-64-4)を添加し、500 μL MESバッファー(10 mM、pH 7.1)で室温で少なくとも30分間、または4°Cで一晩反応させます。
- マウスに投与する場合(セクション4)は、両方のナノプローブフレーバーを11,000 x gで4分間スピンダウンし、上清を吸引して遊離未反応抗体/PEGで溶液を除去し、各フレーバーをMESバッファー(10 mM、pH 7.1)に600 pM濃度で再分散します。ナノ粒子を再懸濁するときは、抗体の変性を防ぐために、超音波への不必要な曝露を最小限に抑えてください。
>4. ナノプローブの注入とイメージング
- セクション1〜3で説明したようにナノプローブ(αFR-NPおよびnt-NP)を調製し、MESバッファー(10 mM、pH 7.1)に各タイプの最終濃度300 pMになるように1:1の比率で混合します。オプションで、各ナノプローブフレーバーの30 pMの参照標準を小さな(100 μL)コニカルチューブに調製します。
- 各マウスに1mLのナノ粒子懸濁液を腹腔内に注入し、腹を優しくマッサージしてナノ粒子を腹腔内に分布させます。マウスをハウジングに戻します。25分以上経過した後、CO2窒息によりマウスを安楽死させる。
- マウスを手術用プラットフォーム上の仰臥位に固定します(腹部全体のイメージングには、プラットフォームを直立顕微鏡ステージに取り付け可能である必要があります)。
- 鋸歯状の鉗子と解剖ハサミを使用して、皮膚を切除して腹膜を露出させ、腹部全体を露出させるために大きな矢状切開(長さ2〜3 cm)を行います。腹膜フラップをプラットフォームに取り付けます。プラスチック製の噴出ボトルを使用して、腹腔内を少なくとも60mLのPBSで洗浄します.
注:腹部全体の遮るもののないイメージングを可能にするには、腸を動員または切除する必要があります。切除のためには、腹腔内への出血を減らすために、腸間膜血管の結紮で切除します。
- あるいは、特定の臓器を画像化するには、PBS洗浄後に臓器を切除し、顕微鏡スライド上に置きます。
- プラットフォームまたはスライドを、直立した光学構成とイメージング用の電動ステージを備えたラマン顕微分光光度計に移します。1,115 cm-1 を中心として、1,200 溝/mm の格子を備えた 300 mW 785 nm ダイオード レーザーを備えた商用システムを使用します。
- 白色光光学系を使用して、ラマンレーザーと同焦点で関心領域に焦点を合わせます。画像化する領域と目的の解像度を選択します。このレポートでは、高速取得モードを使用しました(顕微鏡ステージが絶えず動いている連続レーザー照明下でスペクトルを取得し、有効空間分解能14.2μm×200μm、倍率5倍、対物レンズで100mWの電力、およびポイントあたり<100msの露光)
手記： ステップ4.1の参照ナノプローブを備えたチューブは、必要に応じてイメージング領域内に配置して、その後の分析のための内部参照標準を提供することができます。レーザー以外の無関係な光源が対物レンズに到達しないことを確認してください。
- 必要に応じて、PBS中の4%パラホルムアルデヒドに4°Cで一晩固定することにより、組織学的処理および検証のためにサンプルを調製します。PBSを4°Cで15分間少なくとも2回すすぎます。サンプルを70%エタノール水中に保持し、標準的な組織学的処理とパラフィン包埋まで待ちます。腫瘍の組織学的検証のために、パラフィンブロックの異なる深さの切片(厚さ5 μm)をヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で染色できます。