近位培養システム:細胞間のパラクリンシグナル伝達を研究するためのin vitro培養技術

>A. 細胞調製

1. ヒト初代中皮細胞の単離と培養
   1. ヒト初代中皮細胞(HPMC)をヒト大網から単離し、37°Cおよび5%CO₂.
      で、10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、1%非必須アミノ酸、および1%ビタミンを含む完全増殖培地[ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)]で増殖させます。 手記：HPMC は通常、100% コンフルエンスまで成長します(図 1A)。
2. 卵巣がん細胞の増殖条件
   1. HeyA8卵巣がん細胞を完全増殖培地で37°Cおよび5%CO₂.
      で増殖させます 手記：約80%のコンフルエントまで増殖したHeyA8細胞を使用します(図1B)。

>B. 細胞培養

1. 近位培養のセットアップ
   1. 厚さ10 μmの組織培養処理ポリカーボネートメンブレン、孔径0.4 μm(孔数10⁸孔/cm²)、増殖領域4.67 cm²の6ウェルプレートにはトランズウェルインサートを使用します。必要に応じて、増殖表面積に応じて播種する細胞の数をスケーリングすることにより、さまざまなインサートサイズに最適化します。使用前に、完全増殖培地、トリプシン、およびリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を37°Cまで温めてください。
2. インサートの準備
   1. インサートの膜の下面にHeyA8細胞を播種するには、滅菌鉗子を使用してインサートをパッケージから取り出し、滅菌した15cmの培養皿に逆さまに置きます。
   2. 15cmのディッシュは、倒立インサートを収納できる深さがあるため、適切な滅菌容器と交換してください。実験に応じて、必要な数のインサートを15cmの皿に入れます。
   3. 3つのコントロールと3つの実験条件にラベルを貼り、インサートの端にマーカーでラベルを付けます。
3. がん細胞の準備
   1. 25 cm²フラスコ(~2 x 10⁶細胞)で80%コンフルエンスで増殖したHeyA8細胞をトリプシン化するには、1 mLのトリプシン(0.25%)を40〜60秒間添加し、6 mLの完全増殖培地でトリプシンを中和します。
   2. 細胞を室温(RT)で500 x gで3分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞ペレットを5 mLの完全増殖培地に再懸濁します。トリパンブルー色素排除法を使用して生細胞をカウントします。
4. がん細胞の播種
   1. 100,000細胞/mLの生HeyA8細胞を完全増殖培地に懸濁します。インサートの底部(反転しているため、上を向いています)の完全増殖培地800μLに懸濁した80,000個のHeyA8細胞を慎重に播種します。
   2. 細胞を播種してドーム状に形成し、細胞がインサート上に残るようにします(図1C)。メンブレンの中心から開始し、ゆっくりとピペッティングしながら同心円を描くように外側に移動します。媒体のこぼれを防ぐために、端から3mm以上離れないでください.
      手記：播種される細胞の数は、細胞の増殖速度と実験の期間によって異なります。この近位培養のために播種されたHeyA8細胞の数は最適化され、細胞は3日目の終わりに80〜90%コンフルエントになります。
5. >がん細胞の付着
   1. 15 cmの皿を覆い、インサートを含む皿を慎重にCO₂インキュベーターに移動します。このステップでは、インサート上の培地と細胞の落下を妨げないことが重要です。細胞を37°Cで4時間放置し、がん細胞がインサートに付着するのを待ちます。
6. 中皮細胞の準備
   1. 約4時間後、75 cm²フラスコ(~4 x 10⁶細胞)で100%合流点で増殖したHPMCを2 mLのトリプシン(0.25%)で1〜2分間トリプシン化し、12 mLの完全増殖培地でトリプシンを中和します。
   2. 細胞を500 x gの室温で3分間遠心分離し、細胞ペレットを10 mLの完全増殖培地に再懸濁し、トリパンブルー色素排除法を用いて生細胞をカウントします。
7. 中皮細胞の播種
   1. 300,000細胞/mLの生HPMCを完全増殖培地に懸濁します。2.5 mLの新鮮な完全増殖培地を6ウェルプレートの各ウェルに加えます。インサートが入った15cmのディッシュをバイオセーフティフードに慎重に出します。滅菌鉗子を使用して、インサートを裏返し、6ウェルプレートのウェルに直立するように置き、HeyA8細胞を下面に付着させたHeyA8細胞を完全な増殖培地に浸します(図1C)。
   2. 1.5 mLの増殖培地に懸濁した450,000 HPMCを、HeyA8細胞をウェルの底面に面した表面に取り付けたインサートの内側(図1C)に、またはHPMCコントロール用のHeyA8細胞を含まないインサートに播種します。細胞を含まない増殖培地1.5 mLをHeyA8コントロールに加えます。
8. 近位文化の成長
   1. 近位培養物をCO₂インキュベーターで37°Cおよび5%CO₂で72時間増殖させます。必要に応じて、次のようにして培地を補充できます。
      1. インサートの内側に750 μLを取り出し、750 μLの新鮮な完全増殖培地を加えます。
      2. インサートの外側(6ウェルプレート)に1 mLを取り出し、1 mLの新鮮な完全増殖培地を加えます。1 mLは、1ステップで培地を変更できる利便性のために選択されました。必要に応じて、1.25 mLを取り外して交換できます。

図1:近位培養システムの組み立て。(A)このパネルは、ヒト初代中皮細胞(HPMC)を示しています。(B)このパネルはHeyA8卵巣癌細胞を示しています。スケールバー = 200 μm (A-B)。(C)HeyA8細胞を、0.4μmの細孔を有するトランズウェルインサートの下面に播種した。細胞を接着したら、インサートを増殖培地を含む6ウェルプレートのウェルに入れました。次いで、中皮細胞をインサートに播種して、上面に付着させ、膜によってHeyA8細胞から分離した。メンブレンの0.4μmの細孔は、分泌された因子の交換を可能にしましたが、細胞間の直接接触を阻害しました。