腹腔内層における卵巣癌転移のモデリング:腹膜内層のin vitro 3Dモデルを確立する方法

要約

出典:Peters, P. N. et al.ヒト腹腔の器官型培養における卵巣がん播種の初期段階をモデル化する。J. Vis. Exp.(2015年)

このビデオでは、腹腔の内壁のin vitro 3次元モデルの開発を示しています。この器官型培養は、卵巣がん細胞の接着、浸潤、および増殖の調査に役立ちます。

プロトコル

1. 器官型培養のプレーティング

1. 75 cm²培養フラスコからNOF(正常なオトアル線維芽細胞)を放出し、PBSの10 mlと3 mlの0.25%トリプシン/25 mM EDTAを5分以内にすすぐことで、トリプシンを少なくとも3倍の全成長培地で中和します。
2. トリプシン処理した細胞を50 mLの円錐管に移し、0.5 g x 3分でスピンダウンします。上清を取り除き、細胞を5 mLの全増殖培地に戻します。セルカウンターを使用して、培養フラスコから回収された細胞をカウントします。
3. 適切な容量の完全増殖培地で細胞を希釈し、100 μlあたり2,000-4,000 NOFのプレートに黒く透明な底の96ウェルプレートに載せます。播種する前に、0.5 μg/100 μlのラットテールコラーゲンIを細胞混合物に加えます。細胞を加湿環境で5%_CO2中の37°Cに少なくとも4時間、または細胞がプレート表面に付着するまで
放置します。
4. ステップ1.1および1.2で説明したのと同じ方法を使用して、培養フラスコからHPMC(初代ヒト中皮細胞)を放出します。96ウェルプレートにコラーゲンIをすでに播種したNOFの上に、50μlあたり10,000〜20,000HPMCをプレートするために、適切な量の全増殖培地で細胞を希釈します。実験を開始する前に、細胞を加湿環境下で5%CO₂中37°Cに少なくとも18時間
置いてください。
5. 緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するHeyA8卵巣がん細胞を完全増殖培地で培養します。HeyA8卵巣がん細胞は、カイアシ類cGFP(pCDH-CMV-MCS-EF1)を発現するレンチウイルスベクターの発現により蛍光標識されます。HeyA8卵巣がん細胞は、使用日(対数成長期)に80〜90%がコンフルエントである必要があります。培養プレートから細胞を放出し、ステップ1.1-1.2で説明したのと同じ方法を使用して初代細胞をカウントします。
6. 卵巣がん細胞を、蓋をゆるく密封した円錐形のチューブ内で、37°Cで15〜20分間、完全増殖培地で回復させます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
PBSの	フィッシャーサイエンティフィック	SH3001304
15cmのカルチャーディッシュ	BDバイオサイエンス	353025
L-グルタミンによるDMEM	コーニング	10-013-履歴書
MEMビタミン	コーニング	25-020-CL
MEM 非必須アミノ酸	コーニング	25-025-CIの
ペニシリン-ストレプトマイシン	コーニング	30-002-CIの
シェーカー	サーモフィッシャー	マックスQ 4450
遠心機	エッペンドルフ	5702
孵卵器	サーモフィッシャー	Forma Series II ウォータージャケット付き CO2インキュベーター Model 3100
トリプシンEDTA、1x (0.25%)	コーニング	25-053-CIの
T-75フラスコ	BDバイオサイエンス	353136
T-175フラスコ	BDバイオサイエンス	353112
ピペットチップ	レイニン	P2、P10、P20、P200、P1000
ピペットチップ	コーニング	フィルターチップP2、P10、P20、P200 とP1000
セルカウンター	インビトゲン	伯爵婦人
Countess Cell Counting Chamber スライド	インビトゲン	C10313
トリパンブルーステイン(0.4%)	ギブコ	15250-061
コラーゲンI型(ラットテール)	BDバイオサイエンス	354236
96ウェルプレート、クリアボトム、ブラック	BDバイオサイエンス	353219

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