中皮細胞の単離:ヒト大網組織標本から初代中皮細胞を単離する技術

要約

出典:Peters, P. N. et al. ヒト腹腔の器官型培養における卵巣がん播種の初期段階をモデル化する。J. Vis. Exp.(2015年)

このビデオでは、ヒト大網標本から初代ヒト中皮細胞を単離するプロトコールについて説明しています。中皮細胞は、卵巣がん細胞の接着、浸潤、および増殖を調査するためのin vitro卵巣がんモデルを確立するために使用できます。

プロトコル

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. 形質転換されていない初代間質細胞の単離と培養

1. ヒト組織の収集と調製。
   1. 腹部手術中に除去されたヒト大網(2 cm³)の標本を採取し、直ちに組織をRTリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に浸します(図1A)。3 cm x 2 cmの大網片は、通常、100万個の初代ヒト中皮細胞(HPMC)と200,000個の初代ヒト線維芽細胞または正常な軟膜線維芽細胞(NOF)を産出します。
   2. 収集後できるだけ早く(PBSで< 2時間)0.5 x gで3分間浸したPBSをスピンダウンし、組織を50 mLのコニカルチューブ内の新鮮な20 mL PBSに移します。直径15cmの無菌培養皿にメスでミンチして、組織を5mm3に切ります(図1B)。
2. 初代ヒト中皮細胞の単離
   1. HPMCを単離するには、ミンチ組織を50 mLの円錐チューブに移し、固形片が上部に浮くまで1分間待ちます(図1CおよびD)。HPMCと赤血球(RBC)は、底の液体に存在します。ピペットを使用して、チューブの底から液体を取り出し、新しい円錐形のチューブに入れます。液体を0.5 x gで3分間回転させ、HPMC/RBCペレットから上清を吸引します。
      1. このプロセスを3回繰り返します:ひき肉に20 mlのPBSを加え、組織を浮かび上がらせ、ピペットで底から液体を取り出してHPMC / RBCチューブに入れ、スピンダウンして上清を取り除きます。すべてのスピンが完了し、上清が吸引された後、ペレットにはHPMCとRBCが含まれます。
   2. ペレットからすべての細胞を15 mLの完全増殖培地(10%ウシ胎児血清[FBS]、1%MEMビタミン[93 mg / L]、1%MEM非必須アミノ酸[81.4 mg / L]、1%ペニシリンストレプトマイシン[ペン連鎖球菌、100 U / mlペニシリンおよび100 μg / mlストレプトマイシン]を含むDMEM)中の75 cm²フラスコにプレートします。
   3. 二次PBS洗浄を実施して、追加のHPMCを分離します。
      1. 二次PBS洗浄では、残りの固形組織を200 rpm、37°Cで20 mlのPBSで10分間振とうし、組織が上部に浮くまで1分間待ちます。チューブの底から液体を新しいチューブに移し、0.5 x gで3分間遠心分離し、上清を吸引します。
      2. 二次PBS洗浄液からのすべてのHPMC/RBCを、15 mLの全増殖培地中の別の75 cm²フラスコにプレートします。
   4. 残りのHPMCを単離するには、1:1 0.25%トリプシン25 mM EDTA:PBS溶液20 mLで、20 rpm、37°Cで10分間、ひき肉組織を振とうします。ティッシュを浮き上がらせ、チューブの底にある液体を新しい50 mlチューブに集め、0.5 x gで3分間スピンダウンします。
      1. 上清を吸引し、15 mLの完全増殖培地中の別の75 cm²フラスコにすべてのHPMC / RBCをプレートします。
   5. 播種した細胞を加湿環境で37°Cおよび5%CO₂で培養します。3日目と5日目に15 mLの全増殖培地を添加し、使用済みの培地を取り出さずに、プレーティングした細胞に供給します。HPMCは、分裂する前に5〜7日間培養できます。
      1. すべての実験で低継代HPMC(継代2まで)を使用して、元の表現型の脱分化と修飾を最小限に抑えます。広視野顕微鏡は、できればプラスチック微分干渉コントラスト機能を備えた20倍対物レンズ、または細胞のすべての画像を撮影するための位相差機能を持つ4-20倍対物レンズ(顕微鏡の位相コントラストフィルター)、および免疫組織化学的3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)染色を分析するための明視野の10倍対物レンズ()とともに使用します。
   6. HPMCが立方体であり、免疫組織化学を行うことにより、サイトケラチン8とビメンチンを発現することを確認します(図2A、C、E)。

結果

図 1.初代ヒト軟骨細胞の単離。(A)大網の一部は、手術時にPBSで収集され、検査室に運ばれます。組織を0.5 x g x 3分でペレット化し、新鮮なPBSに移します。(B)大網を10cmのシャーレに移し、PBSで洗浄し、メスで大網を小片(0.5cm3)に切断します。(C-D)組織片は、25 mLの血清学的ピペットを使用して収集され、HPMCの分離のために50 mLの円錐管に移されます。PBSをチューブから取り出し、HPMCをPBSから0.5×g、37°Cでペレット化する(MC、中皮細胞、赤血球、赤血球、Fib、線維芽細胞) (E) NOFをヒアルロニダーゼおよ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
PBSの	フィッシャーサイエンティフィック	SH3001304
片刃のカミソリの刃	フィッシャーサイエンティフィック	12〜640
15cmのカルチャーディッシュ	BDバイオサイエンス	353025
ウシ胎児血清(FBS)	ライフテクノロジー	16000044_3616914956
L-グルタミンによるDMEM	コーニング	10-013-履歴書
MEMビタミン	コーニング	25-020-CL
MEM 非必須アミノ酸	コーニング	25-025-CIの
ペニシリン-ストレプトマイシン	コーニング	30-002-CIの
シェーカー	サーモフィッシャー	マックスQ 4450
遠心機	エッペンドルフ	5702
孵卵器	サーモフィッシャー	Forma Series II ウォータージャケット付き CO2 インキュベーター Model 3100
T-75フラスコ	BDバイオサイエンス	353136
T-175フラスコ	BDバイオサイエンス	353112
ピペットチップ	レイニン	P2、P10、P20、P200、P1000
顕微鏡	ツァイス	アクシオバート 200m
抗インテグリンαVβ3抗体、クローンLM609	EMDミリポア	MAB1976
ベータ 1	オンコシナジー	OS2966
α 5 [CD49e]	IDファーミンゲン	555615
ベータ4 [CD104]	EMDミリポア	MAB 2058
ピペットチップ	コーニング	フィルターチップP2、P10、P20、P200、P1000
ガラスフラスコ