Otrial Cancer Cell Colonizationのモデリング:Murine Oothitum Explantsにおける蛍光標識卵巣癌細胞の乳白色スポットコロニー形成を確立するためのex vivo法

動物が関わるすべての手続きは、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 乳点コロニー形成 Ex Vivo

1. ex vivo大網器官の基礎培養条件の確立
   1. 各オトガムを1つの培養プレートインサートに入れ、20% FCSを含む500 μlのDME/F12培地を含む12ウェル組織培養プレートの1ウェル内に置きます。臓器培養を5%_CO2環境で37°Cに24〜48時間、および/または追加の時間ポイントで維持します。各条件(メディアタイプ/時点など)に対して3つの独立したオメンタ(トリプリケートサンプル)を使用します。
   2. 実験エンドポイントでの組織の完全性を確認するには、ステップ1.1.3で説明されているようにサンプルを固定して処理します。H&E切片上の健康な脂肪細胞と壊死性脂肪細胞をカウントすることで、組織の完全性を評価できます。存在する生体組織の割合を製剤化するには、5つの生体サンプルから最低~120個の細胞が必要です。
   3. 組織機能を測定するには、500 μlのDME/F12培地と20% FCSを含む24ウェルプレートの別々のウェルにオメンタ(n = 3)を置きます。omentaで培地を37°C、5%_CO2環境下で24時間コンディショニングした後、IL-6 ELISAアッセイで使用するために250μlを取り出します。
2. マウス大網とSKOV3ip.1-GFP細胞のex vivo共培養
   1. T-75フラスコ内の10 mLの培地で1x10⁶解凍細胞をピペッティングすることにより、蛍光標識細胞を増殖および調製します。細胞を5%_CO2環境で37°Cで増殖させ、70%のコンフルエンスに達するまで待ちます。トリプシンを添加し、2 x 10⁶細胞/mLの濃度で再懸濁します。
   2. ~6 μlの組織接着剤を培養インサートのメンブレンに塗布し、自然乾燥させます。メンブレンを滅菌水で2回洗って、余分な接着剤を取り除きます。層流フードの下でメンブレンを風乾します。
   3. オメンタを慎重に切除し、滅菌鉗子を使用して接着剤でコーティングされたメンブレンに取り付けます。培地を添加する前に、組織をメンブレンに1分間接着させます。各培養インサートの各オトガムの上に500 μlの細胞懸濁液を加えます。トランズウェルチャンバーの周囲を2.5mlのDME/F-12で満たします。
   4. オメンタを細胞懸濁液と共に5%_CO2環境下、37°Cで6時間インキュベートします。オメンタを慎重に取り出し、~10mlのPBSで洗います。適切な蛍光イメージングシステムを使用して、蛍光がん細胞の病巣を視覚化します。