Otrial Cancer Cell Colonizationのモデリング:Murine Oothitum Explantsにおける蛍光標識卵巣癌細胞の乳白色スポットコロニー形成を確立するためのex vivo法

要約

出典: Krishnan, V. et al. 腹膜脂肪における乳白色スポット構造の卵巣がん転移性コロニー形成を研究するためのIn Vivo and Ex Vivo Approaches (In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose). J. Vis. Exp. (2015)

この動画では、GFP発現卵巣がん細胞を重ね合わせた生体外臓器培養を確立し、大網外植片内での卵巣がんのコロニー形成を研究します。このプロトコルは、転移を促進する乳白色の斑点として知られる大網内の免疫細胞構造を分析します。

プロトコル

動物が関わるすべての手続きは、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 乳点コロニー形成 Ex Vivo

1. ex vivo大網器官の基礎培養条件の確立
   1. 各オトガムを1つの培養プレートインサートに入れ、20% FCSを含む500 μlのDME/F12培地を含む12ウェル組織培養プレートの1ウェル内に置きます。臓器培養を5%_CO2環境で37°Cに24〜48時間、および/または追加の時間ポイントで維持します。各条件(メディアタイプ/時点など)に対して3つの独立したオメンタ(トリプリケートサンプル)を使用します。
   2. 実験エンドポイントでの組織の完全性を確認するには、ステップ1.1.3で説明されているようにサンプルを固定して処理します。H&E切片上の健康な脂肪細胞と壊死性脂肪細胞をカウントすることで、組織の完全性を評価できます。存在する生体組織の割合を製剤化するには、5つの生体サンプルから最低~120個の細胞が必要です。
   3. 組織機能を測定するには、500 μlのDME/F12培地と20% FCSを含む24ウェルプレートの別々のウェルにオメンタ(n = 3)を置きます。omentaで培地を37°C、5%_CO2環境下で24時間コンディショニングした後、IL-6 ELISAアッセイで使用するために250μlを取り出します。
2. マウス大網とSKOV3ip.1-GFP細胞のex vivo共培養
   1. T-75フラスコ内の10 mLの培地で1x10⁶解凍細胞をピペッティングすることにより、蛍光標識細胞を増殖および調製します。細胞を5%_CO2環境で37°Cで増殖させ、70%のコンフルエンスに達するまで待ちます。トリプシンを添加し、2 x 10⁶細胞/mLの濃度で再懸濁します。
   2. ~6 μlの組織接着剤を培養インサートのメンブレンに塗布し、自然乾燥させます。メンブレンを滅菌水で2回洗って、余分な接着剤を取り除きます。層流フードの下でメンブレンを風乾します。
   3. オメンタを慎重に切除し、滅菌鉗子を使用して接着剤でコーティングされたメンブレンに取り付けます。培地を添加する前に、組織をメンブレンに1分間接着させます。各培養インサートの各オトガムの上に500 μlの細胞懸濁液を加えます。トランズウェルチャンバーの周囲を2.5mlのDME/F-12で満たします。
   4. オメンタを細胞懸濁液と共に5%_CO2環境下、37°Cで6時間インキュベートします。オメンタを慎重に取り出し、~10mlのPBSで洗います。適切な蛍光イメージングシステムを使用して、蛍光がん細胞の病巣を視覚化します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
解剖ツール	ファインサイエンスツール	NAの
ガイムサ	フルカ/シグマ・アルドリッチ	48900
5%ホルマリン	シグマ	HT501320
DMEM	コーニング	10-013-履歴書
PBSの	コーニング	21-040-履歴書	カルシウムとマグネシウムなし
コラゲナーゼ	ワージントン	LS004196
ミリセル培養プレートインサート	ミリポア	PICM01250
セルタック	コーニング	354240

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